加味扶正抑瘤湯及聯合吉西他濱對胰腺癌的抑制作用

黎旭光， 劉開睿， 仇成江， 張生， 余麗， 黃有星

（1.廣東省中醫院腹部外科，廣東廣州 510006；2.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東廣州 510405；3.廣東省中醫院甲狀腺血管外科，廣東廣州 510006）

胰腺癌（pancreatic cancer）是一種預后極差的惡性腫瘤，總體5年生存率低于5%[1]。目前，手術和化療是治療胰腺癌的主要手段。由于超過90%的患者在確診時已喪失手術機會，以化療為主的綜合治療的重要性日益突出[2]。吉西他濱（Gemcitabine，GEM）作為胰腺癌的一線化療藥物，其延長的中位生存期僅為5.4～5.6個月，療效亟待改善[3]。中醫藥是腫瘤輔助治療的重要手段，經多年的臨床實踐形成了扶正祛邪、益氣養陰、活血祛瘀等治療法則。加味扶正抑瘤湯由黃芪、龜板、全蝎和四君子湯等組成，具有滋陰補氣、活血祛瘀之功。前期研究表明，此方對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[4-7]，然而關于其對胰腺癌細胞作用的研究尚未見報道。本研究擬探討加味扶正抑瘤湯對胰腺癌細胞Panc-1體內和體外腫瘤生物學行為的影響，并進一步分析加味扶正抑瘤湯聯合一線化療藥物吉西他濱對胰腺癌細胞的作用效果，從而明確加味扶正抑瘤湯在胰腺癌治療中的作用，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞培養胰腺癌細胞株Panc-1購自中科院上海細胞庫，采用含有體積分數10%胎牛血清的高糖DMEM培養于37℃、體積分數5%CO2的培養箱。

1.2藥物、試劑與儀器加味扶正抑瘤湯組方包括生黃芪30 g、西洋參15 g（另煎）、龜板15 g（先煎）、全蝎10 g、白花蛇舌草30 g、王不留行15 g、白術10 g、茯苓15 g、生甘草10 g、牡丹皮10 g、槲寄生15 g等，各味中藥材均購自中國康美藥業；吉西他濱（法國禮來公司，批號：H20161030）。胎牛血清（杭州四季青公司，批號：11011-8611）；DMEM（美國Gibco公司，批號：12100046）；Matrigel基質膠（美國BD公司，批號：YS000649）；MTT試劑盒（中國碧云天公司，批號：C0009）；Annexin V-FITC（美國Thermo公司，批號：BMS500FI-100）。Heracell CO2培養箱（美國Thermo公司）；CS-24超聲水浴鍋（中國朗博公司）；BenchMateC8微量離心機（美國 Oxfordlab公司）；RPR1204V藥品冷藏箱、MK3酶標儀、Attune NxT流式細胞儀（美國Thermo公司）。

1.3藥物制備方法

1.3.1 加味扶正抑瘤湯制備 ①用于大鼠：將上述劑量的中藥置煎煮容器內，加相當于藥材5倍量的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，過濾；藥渣再加3倍量的水，繼續煎煮20 min，過濾；合并2次濾液，于水浴鍋上濃縮成96 mL。②用于細胞：將中藥包按質量1∶15進行水提，水浴鍋60℃超聲浸泡80 min，共3次。過濾、合并濾液，得到終質量濃度為1 g/mL的濃縮液175 mL用于體外實驗，保存至4℃冰箱備用。使用時取出部分濃縮液，經12 000 r/min、15 min離心后，用0.45 μm濾膜過濾后調至pH7.0，在無菌條件下用0.22 μm濾膜過濾備用。

1.3.2 吉西他濱溶液配制 稱取200 mg吉西他濱溶于20 μL DMSO溶液，加4.98 mL高糖DMEM完全培養基制成40 g/L的吉西他濱濃縮液，經無菌過濾后備用。

1.4體外細胞實驗分組與給藥實驗設空白組、中藥組、西藥組、聯合用藥組等4組。空白組：僅加PBS；中藥組（100 g/L加味扶正抑瘤湯）：1 mL 1 000 g/L加味扶正抑瘤湯濃縮液+9 mL完全培養基；西藥組（20 μmol/mL吉西他濱）：取1 mL吉西他濱濃縮液+6.49 mL完全培養基配制成1 mol/L工作液，再取1 mL工作液+49 mL完全培養基配制；聯合用藥組（100 g/L加味扶正抑瘤湯濃縮液+20 μmol/mL吉西他濱）：5 mL 1 000 g/L加味扶正抑瘤湯濃縮液+1 mL吉西他濱工作液+44 mL完全培養基。

1.5 MTT法檢測細胞增殖能力取Panc-1細胞，細胞長滿瓶底80%時，消化細胞，按1×104個/孔接種于96孔板培養24 h，待細胞貼壁后，按不同處理組別分別加入相應含藥培養基。作用24、48、72 h后，每孔分別加入5 g/L MTT溶液20 μL，應用酶標儀于570 nm波長處測定吸光度[D（λ）]。取各復孔D（570 nm）值的平均值作為統計數據。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移及侵襲取20μmol/L Matrigel基質膠，加入80 μmol/L 4℃預冷的無血清高糖DMEM培養基中，制備成100 μmol/L無血清Matrigel混合物。均勻加入Transwell小室，于37℃，體積分數為5%的 CO2的培養箱6 h待Matrigel基質膠凝固。取對數生長期的Panc-1細胞制備成細胞懸液，取1×105個細胞，稀釋至200 μmol/L無血清DMEM培養基中。于24孔板內分別加入800 μmol/L不同處理組的含藥培養基，分別放入含Matrigel基質膠和不含Matrigel基質膠的Transwell小室。將200 μL含1×105個細胞的無血清DMEM細胞懸液均勻加入小室內，隨后將24孔板放入37℃，體積分數為5%的CO2的培養箱。無基質膠的小室孵育24 h（檢測細胞遷移能力），含基質膠的小室孵育36 h（檢測細胞侵襲能力）。取出小室，PBS沖洗，于40 g/L多聚甲醛溶液中固定細胞，1%結晶紫溶液染色，用棉棒將小室內層細胞擦去，自然風干后，于光學顯微鏡下拍照及細胞計數。

1.7 Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡取對數生長期細胞進行消化、離心、重懸；將細胞接種于6孔板內并置入恒溫細胞培養箱繼續培養24 h；使用不同處理組含藥培養基處理細胞；放入37℃恒溫培養箱培養72 h；使用無EDTA胰酶消化細胞，收集細胞懸液，1 500 r/min離心10 min去上清；使用2 mL PBS重懸細胞，再次1 500 r/min離心10 min去上清，重復本步驟1次后去除PBS；加入400 μL的Binding buffer重懸細胞，將細胞分為2管，每管200 mL，其中一管設為空白對照，另一管為處理組繼續加入試劑進行處理；處理組加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，再加入5 μL碘化丙啶混勻后室溫下避光孵育15 min；孵育完畢后于1 h內應用流式細胞儀檢測。

1.8體內成瘤實驗

1.8.1 動物 40只6周齡健康雄性C57/BL小鼠，體質量約0.02 kg，購于中山大學動物實驗中心。

1.8.2 分組、造模與給藥 將40只小鼠分為4組，即空白組、中藥組、西藥組、聯合用藥組，每組10只。每組小鼠均自由飲水、進食。適應性飼養3 d后，于小鼠左上肢內側注射1×107個Panc-1胰腺癌細胞，建立胰腺癌小鼠動物模型。建模后，空白組自由飼養；中藥組給予劑量為400 g/kg的加味扶正抑瘤湯灌胃，每日2次；西藥組給予劑量為0.4 g/kg吉西他濱溶液灌胃，每日2次；聯合用藥組給予0.4g/kg吉西他濱+400 g/kg加味扶正抑瘤湯灌胃，每日2次。

1.8.3 指標觀察 21 d后處死小鼠取瘤體，肉眼觀察不同分組小鼠腫瘤生長情況。剝離瘤塊，稱取瘤質量，按下式計算腫瘤抑制率（p）。抑制率（%）=[（空白組平均瘤質量-實驗組平均瘤質量）/空白組平均瘤質量]×100%。用40 g/L多聚甲醛將標本固定并拍照。

1.9統計方法采用SPSS 21.0（IBM）統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，數據分析前均進行正態性檢驗及方差齊性檢驗排除抽樣誤差，多組比較采用方差分析或Kruskal-Wallis檢驗，組間比較采用Bonferroni法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1加味扶正抑瘤湯對胰腺癌細胞Panc-1增殖功能的影響圖1結果顯示：中藥組、西藥組、聯合用藥組24 hD（570 nm）與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。各組48、72 hD（570 nm）比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。進一步通過Bonferroni法進行組間差異比較發現，藥物作用48 h后，聯合用藥組D（570 nm）明顯低于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05），而中藥組、西藥組D（570 nm）與空白組比較，差異無統計學意義（P＜0.05）。提示聯合用藥相對于單獨用藥可以更有效抑制胰腺癌細胞增殖。藥物作用72 h后，與空白組比較，西藥組、聯合用藥組D（570 nm）明顯降低（P＜0.05），且聯合用藥組D（570 nm）低于西藥組，而中藥組D（570 nm）差異無統計學意義（P＜0.05）。提示西藥組對胰腺癌細胞的抑制作用不及聯合用藥組。上述結果綜合提示，加味扶正抑瘤湯對胰腺癌Panc-1細胞增殖無顯著抑制作用，但可以加強吉西他濱對胰腺癌Panc-1細胞增殖的抑制效果。

圖1 各組不同時間段內胰腺癌Panc-1細胞增殖能力比較Figure 1 Comparison of the proliferation of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups in different time periods()

2.2加味扶正抑瘤湯對胰腺癌Panc-1細胞遷移與侵襲的影響遷移結果顯示：空白組、中藥組、西藥組及聯合用藥組穿膜細胞個數分別為（166.67±18.358）、（158.56 ± 18.07）、（90.44±16.024）、（47.89±14.33），由方差分析得F=103.088，P＜0.01；進一步經Bonferroni檢驗，與空白組比較，除中藥組，其他2組穿膜細胞個數均降低（P＜0.05），且聯合用藥組降低更明顯。見圖2。

侵襲結果顯示：空白組、中藥組、西藥組及聯合用藥組穿膜細胞個數分別為（108.78±13.055）、（102.67±12.689）、（44.44±12.218）、（17.11±8.978），由方差分析得F=128.456，P＜0.01；進一步經Bonferroni檢驗，與空白組比較，除中藥組，其他2組穿膜細胞個數均降低（P＜0.05），且聯合用藥組降低更明顯。見圖3。

圖2 各組胰腺癌Panc-1細胞遷移能力比較Figure 2 Comparison of the migration of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

圖3 各組胰腺癌Panc-1細胞侵襲能力比較Figure 3 Comparison of the invasion of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

上述2項結果提示，雖然100 g/L的加味扶正抑瘤湯對胰腺癌Panc-1細胞的遷移侵襲能力沒有顯著影響，但可以顯著提高吉西他濱對胰腺癌Panc-1細胞遷移侵襲能力的抑制作用。

2.3加味扶正抑瘤湯對胰腺癌Panc-1細胞凋亡功能的影響圖4結果顯示，空白組、中藥組、西藥組及聯合用藥組晚期凋亡率分別為（2.951±0.996）%、（7.293±2.581）%、（29.366± 4.904）%、（55.100±4.882）%，由Kruskal-Wallis檢驗得F=32.522，P＜0.01。進一步經Bonferroni檢驗，與空白組比較，除中藥組外，其他2組細胞凋亡率均明顯增加（P＜0.05），且聯合用藥較單獨化療能更顯著誘導細胞凋亡。提示加味扶正抑瘤湯可以協同吉西他濱誘導胰腺癌細胞凋亡。

圖4 各組胰腺癌Panc-1細胞凋亡情況比較Figure 4 Comparison of the apoptosis of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

2.4加味扶正抑瘤湯對小鼠體內胰腺癌瘤體的影響小鼠成瘤實驗檢測胰腺癌細胞體內生長情況結果顯示，中藥組、西藥組及聯合用藥組體內抑瘤率分別為（7.20±3.52）%、（38.90±5.91）%、（61.63±6.46）%，由方差分析得F=226.410，P＜0.01；進一步經Bonferroni檢驗，發現任何2組體內抑瘤率差異均具有統計學意義（P＜0.05），其中聯合用藥組的抑瘤率相對西藥組平均高22.73%。提示加味扶正抑瘤湯可以協同吉西他濱抑制胰腺癌細胞Panc-1在體內生長。見圖5。

3 討論

胰腺癌是惡性度極高的消化系統腫瘤，其發病率及死亡率近年來仍有上升趨勢。由于具有起病隱匿、進展迅速、早期轉移等特點，胰腺癌手術可切除率不足10%，5年生存率低于5%，預后極差，嚴重影響國民健康[2]。吉西他濱作為治療胰腺癌的一線化療藥物，能改善患者生存質量，但由于胰腺癌細胞對吉西他濱存在先天或后天的耐藥性，導致其在改善生存期方面不甚理想，吉西他濱治療后1年生存率仍不足20%[8]。近年來許多研究發現采用吉西他濱聯合中藥提取物或湯劑治療，可以有效逆轉胰腺癌對吉西他濱的耐藥性并提高其治療敏感性，這些研究結果揭示了胰腺癌中西醫結合治療模式的臨床應用前景[9，10]。

胰腺癌屬中醫學“積聚”、“黃疸”、“腹痛”、“伏梁”等范疇。中醫學認為其病機以脾胃虛損、正氣虧虛為本，濕瘀毒內蘊為標，標本相互轉化，治療首當辨別標本虛實，施以清熱利濕、疏肝理氣、益氣健脾等療法[11]。加味扶正抑瘤湯為本院外科治療腫瘤的經驗方，通過扶正培本可改善機體內環境，提高自身抗腫瘤能力，通過抑瘤散結消癥可殺滅體內惡性腫瘤細胞。該方由生黃芪、西洋參、龜板、全蝎、白花蛇舌草、王不留行、白術、茯苓、生甘草、牡丹皮、槲寄生組成。以生黃芪、西洋參補氣為君藥；以龜板、槲寄生滋陰補腎，全蝎、白花蛇舌草攻散瘀毒為臣藥；白術、茯苓、甘草，取四君子湯之意，益氣健脾；以王不留行、牡丹皮活血祛瘀，生甘草緩急止痛，白花蛇舌草兼解毒利濕為佐藥，生甘草調和諸藥，兼為使藥。諸藥配伍，具有補氣滋陰、健脾補腎，活血祛瘀解毒的功效，達到扶正抑瘤的目的。既往研究表明，加味扶正抑瘤湯可以通過抑制Bcl-2 mRNA及促進p53 mRNA表達起到抑制結腸癌HT-29細胞增殖功能[4]；在肝細胞癌中，隨著藥物濃度的增加，可以顯著抑制肝癌細胞增殖遷移侵襲能力[6]；對晚期前列腺癌還能顯著減少骨轉移灶數目，延長生存期，提高生活質量[5，7]。上述研究表明，加味扶正抑瘤湯可通過多種途徑發揮抗腫瘤作用。

圖5 各組小鼠體內胰腺癌瘤體比較Figure 5 Comparison of the tumor growth in various groups

本研究首先驗證加味扶正抑瘤湯對胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及體內生長的影響。盡管文獻報道加味扶正抑瘤湯可以顯著抑制多種惡性腫瘤進展，但是本研究結果卻發現治療劑量的加味扶正抑瘤湯無論對胰腺癌細胞還是小鼠體內瘤體均無顯著抑制效應。該結果一方面從分子機制角度提示不同組織臟器的惡性腫瘤在發生發展中存在差異，另一方面從傳統醫學的角度也說明胰腺癌的中藥治療不僅僅局限于扶正及抑瘤之法，還需要根據疾病的不同階段辨證施治，符合中醫學“同病異治”的原則。本研究進一步檢驗聯合用藥組與單藥應用在抑制腫瘤發展上的區別，結果顯示，聯合用藥組對胰腺癌Panc-1細胞體內外生物學行為的抑制效果顯著強于吉西他濱單藥的效果。雖然該研究未進一步揭示背后的分子機制，但是結合目前的研究報道，推測加味扶正抑瘤湯可能通過協同吉西他濱進一步放大下游信號傳導途徑對胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的抑制效果。該現象潛在的具體機制仍有待進一步深入研究。

綜上所述，加味扶正抑瘤湯對胰腺癌Panc-1細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡方面無顯著抑制作用，但是在與吉西他濱聯用后，可以顯著提高吉西他濱對胰腺癌細胞的抑制作用，有望在胰腺癌的治療中扮演增效劑的作用，起到輔助化療的效果。