槲皮素對人骨肉瘤MG-63細胞周期及自噬流的影響

符芳姿， 許振勝

（海口市人民醫(yī)院，海南海口 570208）

骨肉瘤（osteosarcoma）是小兒和青少年惡性程度最高的骨癌之一，具有高轉移風險[1]。大約40%的本病患者在診斷時已發(fā)生轉移，僅20%的患者能達到長期存活[2]。傳統(tǒng)的手術及化療并未能明顯改善骨肉瘤的總體生存率[3]。因此，迫切需要研發(fā)新的骨肉瘤治療策略，以提高骨肉瘤的治療效果。

槲皮素（C15H10O7）屬于生物活性類黃酮，天然存在于日常食品和傳統(tǒng)中藥如連翹、紅八角蓮、紅麻等中。槲皮素具有較高的親脂性，可自由穿過細胞膜，觸發(fā)胞內(nèi)某些生化反應，干預細胞生命活動。有研究表明，槲皮素具有抗癌作用[4-6]。對骨肉瘤細胞可抑制其增殖、遷移侵襲，促進凋亡[4，7]。

本課題組前期運用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測槲皮素對人骨肉瘤MG-63細胞的增殖抑制作用，運用流式細胞法（FCM）檢測槲皮素對人骨肉瘤MG-63細胞周期和細胞凋亡的影響，結果顯示：①細胞增殖：與空白對照組（以含DMSO的培養(yǎng)液為溶劑對照）比較，50、100、150、200、250 μg/mL槲皮素干預組24、48、72 h均顯著抑制骨肉瘤MG-63細胞活力（P＜0.05或P＜0.01），且呈時間、劑量依賴性。②細胞凋亡：與空白對照組比較，150、200、250 μg/mL槲皮素各干預組顯著促進骨肉瘤MG-63細胞早期凋亡（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性；且200 μg/mL槲皮素可顯著促進骨肉瘤MG-63細胞的晚期凋亡和壞死。表明槲皮素可顯著抑制MG-63細胞增殖，并誘導其凋亡，呈量效關系[8]。因此，本研究在前期研究基礎上，探討槲皮素對人骨肉瘤MG-63細胞生長周期及自噬影響，進一步為槲皮素治療骨肉瘤提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞來源與培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63細胞株來源于美國ATCC細胞庫。將細胞置于37℃、飽和濕度、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h后，顯微鏡下觀察細胞貼壁情況及細胞狀態(tài)。4 d左右細胞密度達到大約85%左右后傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2藥物、試劑與儀器槲皮素（中國藥品生物制品檢定所提供）。單體紅色熒光蛋白（mRFP）—綠色熒光蛋白（GFP）—微管相關蛋白輕鏈3（LC3）自噬雙標腺病毒，來源于上海漢恒生物科技有限公司，批號：AP12121706。胰蛋白酶（美國Gibco公司）；碘化丙啶（PI，美國Sigma公司）。超凈工作臺（美國Nuaire公司）；臺式冷凍離心機（深圳黑馬公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；Attune?NxT流式細胞儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.3流式細胞術檢測細胞周期實驗設4組：空白對照組，150、200、250 μg/mL槲皮素組。空白對照組以0.1%DMSO的培養(yǎng)液作為溶劑對照；150、200、250 μg/mL槲皮素組分別予相應質(zhì)量濃度槲皮素處理細胞24 h。取各組細胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化細胞，細胞貼壁脫落，吹打成單個細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL。1 000 r/min離心棄去上清，加入1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）吹至細胞懸浮。過濾細胞懸液。重復2次。后用200 μL結合緩沖液再次震蕩至細胞懸浮，加入800 μL體積分數(shù)為75%的乙醇預冷后固定，再次以1 000 r/min離心10 min棄去上清，吹至細胞懸浮。重懸細胞至500 μL PBS緩沖液中，避光孵育30 min。加PI至終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，室溫避光30 min。上流式細胞儀分析，計數(shù)細胞周期各期的細胞數(shù)目。

1.4熒光顯微鏡觀察mRFP-GFP-LC3自噬雙標腺病毒轉染后自噬小體的形成和自噬流的變化[9]實驗設2組：空白對照組、槲皮素組。空白對照組以0.1%DMSO的培養(yǎng)液作為溶劑對照；槲皮素組給予150、200、250 μg/mL槲皮素處理細胞24 h。次日鏡下觀察細胞，匯合率為70%左右可進行mRFP-GFP-LC3轉染。加入的病毒量感染復數(shù)（MOI）為 10、30、50、100、300、500 內(nèi)，每個MOI值設置2個復孔。將原培養(yǎng)液吸干，加入原來培養(yǎng)液1/2的體積的培養(yǎng)液。根據(jù)公式換算：病毒個數(shù)=轉染時細胞數(shù)（傳代計數(shù)細胞數(shù)×2）×MOI；病毒體積數(shù)=病毒個數(shù)/病毒滴度。原裝的腺病毒的病毒滴度是10 PFU/mL，根據(jù)設置的MOI與換算公式，以完全培養(yǎng)基將腺病毒稀釋到特定濃度，然后加入相應的孔中。把含腺病毒的培養(yǎng)基吸干凈，后加入原來體積量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后熒光顯微鏡觀察。隨機選8個視野（每個視野0.17 mm2），計算紅色熒光點（指示自噬溶酶體）和綠色熒光斑點（指示自噬體）的數(shù)量。最后將拍攝好的紅色和綠色熒光圖片，用Photoshop進行圖片合成后，再進行統(tǒng)計。

1.5統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0軟件或Prism 5.0（GraphPad）或SAS軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差()表示。實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析方法詳見各圖表注釋。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1槲皮素對MG-63細胞體外生長周期的影響表1、圖1結果顯示：與空白對照組比較，槲皮素各干預組處于G1期的骨肉瘤MG-63細胞數(shù)顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），處于S期的骨肉瘤MG-63細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），此外，250 μg/mL槲皮素干預組顯著增加G2期骨肉瘤MG-63細胞數(shù)（P＜0.01）。表明槲皮素可誘導骨肉瘤MG-63細胞生長周期停滯在G1期。

2.2槲皮素對mRFP-GFP-LC3腺病毒轉染MG-63細胞自噬流的影響圖2結果顯示，與空白對照組比較，槲皮素干預組顯著增加融合（Merge）圖的紅色斑點（P＜0.01），顯著減少Merge圖的黃色斑點（P＜0.01），這些結果表明槲皮素誘導自噬小體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體的進程順暢，即槲皮素顯著上調(diào)骨肉瘤MG-63細胞自噬水平。

表1 MG-63細胞周期分布Table 1 The distribution of MG-63 cell cycle（，n=3，p/%）

表1 MG-63細胞周期分布Table 1 The distribution of MG-63 cell cycle（，n=3，p/%）

注：單因素方差分析；①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對照組比較

G2期細胞0 0 0 0.19±0.03②分組空白對照組150 μg/mL槲皮素組200 μg/mL槲皮素組250 μg/mL槲皮素組G1期細胞63.89±3.25 82.82±8.10①86.41±3.56②91.86±1.72②S期細胞36.10±3.25 17.17±8.10①13.58±3.56②7.93±1.65②

圖1 細胞周期流式圖Figure 1 The FCM plot for MG-63 cell cycle

圖2 槲皮素對mRFP-GFP-LC3轉染MG-63細胞自噬流的影響Figure 2 The effect of quercetin on autophagy flux in mRFP-GFP-LC3 plasmid transfected human

3 討論

細胞周期，指細胞分裂完成后至下一個分裂結束的整個過程，一般分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）及細胞分裂期（M期）。本研究結果顯示，槲皮素顯著增加了停滯在G1期的MG-63細胞數(shù)量。G1期為DNA合成前期，這期細胞為不再增殖細胞，是一些已經(jīng)脫離細胞周期，永遠喪失分裂能力，且日趨衰老的死亡細胞，這類細胞結構和功能發(fā)生高度分化，對腫瘤增長沒有作用，因此該期細胞所占數(shù)量越多，腫瘤的惡性程度越低。這表明槲皮素能有效抑制MG-63細胞進行DNA合成，使其停滯在細胞周期的G1期。槲皮素的這一生物學效應類似于其作用于胃癌SGC-7901細胞[10]、人宮頸癌HeLa細胞[11]、骨肉瘤143B細胞[12]的效應。因此，我們從體外實驗證實了槲皮素能抑制骨肉瘤的增殖，誘導其停留在細胞周期的G1期。

自噬是指亞細胞膜經(jīng)歷一個動態(tài)形態(tài)學改變（如自噬體形式、與溶酶體結合形成自噬溶酶體），降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞器的過程。當細胞遇到環(huán)境脅迫如饑餓或病原體感染時，自噬作為能量的來源，給細胞提供氨基酸以維持細胞存活，對細胞起保護作用。越來越多的證據(jù)表明，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在腫瘤形成的早期階段，自噬活動經(jīng)常抑制癌細胞。一些抗癌藥物在導致癌細胞凋亡的同時，也可誘導癌細胞發(fā)生自噬相關性細胞死亡[13]。自噬在骨肉瘤的發(fā)生、生長、分化和抗藥方面起了關鍵作用，已成為目前研究骨肉瘤的熱點[14]。

本課題組在檢測骨肉瘤MG-63細胞自噬情況時，選用了mRFP-GFP-LC3雙熒光標記腺病毒轉染MG-63細胞模型。與對照組比較，槲皮素處理組GFP標記的藍色熒光顯著減少，merge圖中黃色斑點熒光幾乎不可見，mRFP標記紅色熒光斑點明顯，這表明槲皮素可促進MG-63細胞自噬流進程，誘發(fā)細胞自噬。既往有研究表明，槲皮素對其他細胞系（如原代卵巢癌細胞[15]、原發(fā)性滲出性淋巴瘤細胞[16]、人食管癌Eca-109細胞[17]）有促細胞自噬作用，這支持了我們的實驗結果。同樣，這也是第一次運用雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3）轉染MG-63細胞模型來證明槲皮素具有促骨肉瘤自噬的作用。

然而，有研究發(fā)現(xiàn)，在化療情況下自噬也可作為腫瘤細胞發(fā)揮自我防御的機制[12]。結合前期基礎研究結果——槲皮素處理骨肉瘤MG-63細胞可致使其增殖、活性受到抑制，我們考慮槲皮素所誘發(fā)的自噬，更大可能是促進MG-63細胞發(fā)生自噬相關性細胞死亡。但其防御作用不能排除，仍需進一步體外細胞實驗加以分析。

綜上所述，槲皮素可抑制人骨肉瘤MG-63細胞的增殖，使其停滯在細胞周期G1期，呈劑量依賴性地促進骨肉瘤MG-63細胞發(fā)生自噬，從而誘發(fā)骨肉瘤細胞死亡。