白羽王鴿卵清蛋白關聯蛋白Y基因(OVALY)克隆與生物信息學分析

徐小欽，杜 雪，李國勤，4，張 龍，陶爭榮，盧立志，4，*

(1.浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州310021； 2.西華師范大學 生態研究院，四川 南充637000； 3.南京農業大學 動物科技學院，江蘇 南京 210095； 4.農業農村部農產品信息溯源重點實驗室，浙江 杭州 310021)

OVALY(ovalbumin-related protein Y)是蛋清中一種常見蛋白，在雞蛋清中含量很少[1-2]，但在鴿蛋清中卻是最主要的蛋白[3]。Guérin-Dubiard等[4]于2005年采用高通量基因組測序的方式，獲得了雞的OVALY基因堿基序列，同時發現該基因存在兩種基因亞型。2006年Guérin-Dubiard等[5]運用雙向凝膠電泳技術分離鑒定了雞OVALY蛋白，其分子量大小為53 ku。通過軟件預測該蛋白分子量為55 ku，包含21個磷酸化位點和4個N-鏈接的糖基化位點，造成此種差異的原因尚未知曉。雖然該蛋白在蛋清中含量少，但有研究表明在雞受精卵孵化第7天的卵清中含量迅速增加，因此推測其可能參與了雞胚胎發育調控，具體機制尚不明了[6]。2017年Ren等[3]對鴿蛋清蛋白進行分離，利用MALDI-TOF-MS技術進行鑒定，發現OVALY蛋白為鴿蛋清中最主要的蛋白。但關于鴿子OVALY基因及其對應的蛋白的報道鮮有所聞。巖鴿OVALY基因預測序列于2015年已經發布，但其確切序列尚未獲得。

為了研究鴿蛋清中最主要蛋白OVALY的編碼基因，本試驗運用RACE技術獲得白羽王鴿OVALY基因全部的cDNA序列，并利用生物信息學數據庫和相關軟件進行分析，預測其功能結構。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白羽王鴿輸卵管膨大部組織樣本采集自平陽縣鰲峰鴿業有限公司，保存于液氮中。

1.2 試驗方法

1.2.1 輸卵管膨大部中總RNA提取

將適量樣本置于盛有液氮的研缽中，迅速研磨直至粉末狀，加入Trizol試劑，按照使用說明書進行實驗操作，提取輸卵管膨大部總RNA。

1.2.2 反轉錄

反轉錄實驗試劑采用TransScript First-strand cDNA Synthesis SuperMix(TaKaRa，大連)試劑盒。嚴格按照試劑盒的使用說明書進行操作。

1.2.3OVALY基因克隆

根據巖鴿OVALY(GenBank∶XM_005509738.1)基因的預測序列，設計擴增該基因部分片段引物OVALY-F和OVALY-R，根據獲得的OVALY部分片段序列分別設計3′和5′RACE引物，分別為OVALY-3-GSP1、OVALY-5-GSP1和OVALY-5-GSP2(表1)。引物合成由上海英駿生物技術有限公司完成。

根據SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(TaKaRa，大連)說明書步驟擴增5′-UTR和3′-UTR區域；嚴格按照pEASY T1 cloning kit試劑盒(TransGen Biotech，北京)使用說明書進行克隆，并將獲得的產物進行測序[7]。

1.2.4 蛋白質序列分析

利用NCBI的Blast功能進行氨基酸同源性比對。用在線工具ExPASy-PROSITE和ExPASy-ProtParam(http://www.expasy.org)預測蛋白質的基本理化性質。利用SWISSMODEL軟件(http://swissmodel.expasy.org)選擇同源建模法構建OlCtpE蛋白的三級結構。用NetNGlyc 1.0預測糖基化位點，用SignalP 4.1預測信號肽。

表1 OVALY基因引物序列

2 結果與分析

2.1 OVALY基因克隆

白羽王鴿OVALY基因cDNA全長為2 068 bp，其中5′非編碼序列為180 bp，3′非編碼序列為720 bp，開放閱讀框為1 164 bp；編碼的蛋白分子量約44.19 ku，含氨基酸殘基388個(GenBank∶KX230792)。

2.2 與其他物種氨基酸序列比對

通過NCBI中Blast功能，將白羽王鴿的OVALY預測氨基酸序列與其他鳥類的該基因進行比對。發現與朱鹮(Nipponianippon)同源性最高(81%)；與白尾鷹(Haliaeetusalbicilla)、沙雞(Pteroclesgutturalis)、鴨(Anasplatyrhynchos)、雞(Gallus)、鵪鶉(Coturnixjaponica)的同源性分別為80%、79%、69%、65%、66%。采用N-J的方法構建蛋白質系統發育樹，結果見圖1。

2.3 氨基酸構成及性質預測

利用ExPASy-ProtParam在線軟件預測OVALY蛋白的氨基酸構成及性質。該蛋白分子量約44.19 ku，氨基酸序列中谷氨酸(Glu)和賴氨酸(Lys)的使用頻率最高，分別為10.80%和9.50%，色氨酸(Trp)使用頻率最低(0.8%)，其他氨基酸的使用頻率見表2。理論等電點約為5.09，其中正電荷氨基酸殘基49個，負電荷氨基酸殘基63個；蛋白質氨基酸殘基親疏水性約為-0.315，脂溶性指數約為85.67，不穩定系數約為38.00，體外半衰期約為30 h。說明該蛋白為親脂的堿性蛋白，且在體內穩定存在[8-9]。

圖1 系統發育樹(N-J)Fig.1 Phylogenetic tree with branch length (N-J)

表2 鴿OVALY氨基酸組成

2.4 高級結構預測

通過PSIPRED預測了白羽王鴿OVALY蛋白的二級結構。該蛋白含有10個α螺旋和14個β折疊，由無規則卷曲連接。利用SWISS-MODEL預測鴿OVALY蛋白的三級結構。3D結構模型如圖2所示。

2.5 糖基化和磷酸化位點預測

利用NetNGlyc 1.0 Server在線軟件預測OVALY蛋白序列中Asn-Xaa-Ser/Thr三肽概率大于50%的N-連接糖基化位點，共發現了4個，分別位于62、95、215和374處；利用NetOGlyc 3.1 Server在線軟件未發現概率大于50%的O-GalNAc連接糖基化位點。利用NetPhoQ2.0server在線軟件預測概率大于50%的磷酸化位點，共發現了22個，其中絲氨酸(Ser)15個，分別位于34、52、83、97、99、148、200、261、308、314、318、321、345、355和356處；酪氨酸(Tyr)5個，分別位于16、79、107、235和385處；蘇氨酸(Thr)2個，分別位于202和343處。

2.6 蛋白質結構域分析

圖2 鴿OVALY蛋白的3D結構圖Fig.2 Tertiary structure of pigeon OVALY protein

通過CDD數據庫對OVALY蛋白保守結構域進行分析，發現該蛋白具有絲氨酸蛋白酶抑制劑反應中心結構域，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員(圖3)。

SignalP4.0在線軟件分析，在該蛋白中不具有信號肽區域；利用TMHMM Server v. 2.0軟件分析，該蛋白不具有跨膜區域。因此，該蛋白可能通過非經典分泌途徑完成分泌。

圖3 鴿OVALY蛋白的結構域分析Fig.3 Conserved domain analysis of pigeon OVALY

3 討論

基因翻譯成氨基酸序列后，主要以糖基化和磷酸化進行修飾，在許多生物進程中具有重要作用。研究表明，蛋白的糖基化參與蛋白質折疊、細胞識別、免疫反應等；磷酸化在信號轉導、基因表達、細胞周期調控中起到關鍵性作用[10-14]。具有免疫功能的蛋白大多都含有糖基化修飾位點，在生物醫學研究方面具有重要意義[15]。在白羽王鴿和雞的OVALY蛋白中均含有4個N-連接糖基化位點，磷酸化位點分別為22個和21個，兩個物種的該蛋白具有相似的翻譯后修飾。蛋白質的翻譯后修飾，對蛋白質的結構和功能具有重要作用，因此對被修飾的結構位點進行深入分析具有重要意義。

真核蛋白質分泌包括經典和非經典兩種分泌途徑。經典分泌途徑是指內質網-高爾基體途徑，這種途徑是大多數蛋白的分泌方式；只有小部分無信號膚的蛋白質不依賴該途徑，就能從胞內運輸到細胞外，因此叫做非經典分泌蛋白。一般非經典分泌蛋白是相對分子量12～45 ku的小分子蛋白，缺少潛在糖基化位點和信號肽等結構，受溫度、能量等影響較大[16]。本研究中白羽王鴿OVALY蛋白序列中不具有信號肽區域和跨膜結構，且分子量大于12 ku，小于45 ku，因此推斷該蛋白的分泌方式為蛋白質非經典分泌途徑；但是該蛋白又包含了4個潛在糖基化和22個潛在磷酸化位點，故而其分泌方式有待進一步探討[17]。

經蛋白質保守結構域分析發現，鴿OVALY蛋白具有絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族(Serpin superfamily)特有的反應活性中心，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員。在雞蛋中共發現了15種絲氨酸蛋白酶抑制劑，而OVALY蛋白就是其一[18]。這些蛋白是雞蛋結構的重要組成成分(蛋殼、蛋清、蛋黃、卵黃膜等)，其生理功能還需要深入研究[19]。有研究顯示，這些蛋白與哺乳動物的對應蛋白具有一定的同源性，可能參與了細胞增殖、卵泡血管形成、禽類胚胎體外發育、蛋殼生物礦化等[20]。在雞受精卵孵化過程中，OVALY含量變化顯著，推測可能是胚胎的胃腸道蛋白酶或蛋黃蛋白酶的抑制劑[21]。鴿的OVALY蛋白是否具有絲氨酸蛋白酶抑制劑生物活性尚未知曉，作為鴿卵中含量最高的蛋白，可能還具有不為人知的潛在功能，需要進行大量深入的研究。