利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化秸稈腐熟劑的腐解條件

蘇 瑤，賈生強，2，何振超，楊艷華，2，喻 曼，陳喜靖，沈阿林，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江農(nóng)林大學 環(huán)境與資源學院，浙江 杭州311300)

稻-麥輪作是我國長江中下游地區(qū)主要的農(nóng)業(yè)耕作方式，隨著水稻產(chǎn)量的不斷提升，水稻秸稈量也逐年增加。據(jù)報道，2016年我國長江中下游地區(qū)的水稻秸稈量約9 285萬t[1]。水稻秸稈直接還田可有效提升土壤養(yǎng)分，是目前秸稈資源化利用的主要手段。然而，在實際生產(chǎn)中秸稈直接還田仍存在一系列問題[2-3]：在稻-麥輪作區(qū)域，由于茬口緊，大量水稻秸稈無法及時腐解，造成下茬小麥播種質(zhì)量差，嚴重影響小麥的出苗和植根[4-5]；此外，大量秸稈還田為病原菌的休眠和繁殖創(chuàng)造了適宜的環(huán)境條件，使田間土壤病原菌數(shù)量不斷累積，導(dǎo)致小麥病害加劇，造成減產(chǎn)[6]。

近年來，國內(nèi)外學者一直致力于研發(fā)加速秸稈腐解的產(chǎn)品和技術(shù)。大量研究結(jié)果表明，秸稈腐熟劑的添加可有效增加土壤微生物量[7]，促進秸稈較快腐解[8]，但田間使用效果不穩(wěn)定[9]。一方面，由于腐熟劑多為微生物菌劑，在秸稈腐解過程中會受周圍環(huán)境因素，包括溫度、含水量、腐熟劑用量、碳氮比(C/N)等的影響[10-11]；另一方面，當前秸稈腐熟劑品種多，針對不同區(qū)域及秸稈類型，其腐解效果存在較大差異[12-14]。目前，關(guān)于水稻秸稈高效腐熟劑篩選及其最佳腐解條件的研究已有一些報道[7]，但這些研究主要通過傳統(tǒng)的單因素試驗來確定最佳條件，不能很好地反映影響因子之間的相互作用對腐解效果的影響，結(jié)果可靠性較低。響應(yīng)曲面法(response surface method，RSM)作為優(yōu)化隨機過程的有效統(tǒng)計學試驗方法，已成熟應(yīng)用于諸多復(fù)雜的反應(yīng)系統(tǒng)和工藝條件優(yōu)化，但在腐熟劑的秸稈腐解條件優(yōu)化方面應(yīng)用較少。此外，過去有關(guān)秸稈腐熟劑的應(yīng)用研究中，多以添加尿素作為調(diào)節(jié)C/N的主要方法[15]。實際上，相對于尿素而言，濃縮沼液中不僅含有氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素，還含有鈣、鎂、鐵、鋅等微量營養(yǎng)元素，以及豐富的氨基酸、生長素、維生素、植物激素等生物活性物質(zhì)[16-18]，可以縮短腐熟劑中微生物的適應(yīng)期，提高其代謝活性，進而更有效地促進秸稈的腐解[19-21]。然而，目前有關(guān)濃縮沼液對秸稈腐熟劑作用效果的影響及其最佳使用量等的研究還相對較少。鑒于此，本研究以水稻秸稈為研究對象，對目前市場上的4種秸稈腐熟劑進行篩選，選擇腐解效果較好的腐熟劑，進一步探究其在不同溫度、含水量，以及不同腐熟劑和濃縮沼液添加量條件下對秸稈腐解的影響，并通過RSM分析、預(yù)測腐熟劑的最佳腐解條件，以期為水稻秸稈還田的快速腐解提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用秸稈取自浙江省桐廬縣某稻田，采用抽選的方法從一片稻田中抽取適量水稻作為研究對象，其總碳、氮含量分別為392、5.08 mg·g-1，碳氮比(C/N)為77.2。待秸稈自然風干后，剪成2～4 cm小段。

供試腐熟劑包括粗纖維降解菌劑(廣州市微元生物科技有限公司，標記為A)、有機物料腐熟菌劑150(江蘇綠科生物技術(shù)有限公司，標記為B)、有機物料腐熟劑(上海綠樂生物科技有限公司，標記為C)、發(fā)酵劑(河南省沃寶生物科技有限公司，標記為D)。

試驗用濃縮沼液系取自浙江某養(yǎng)豬場膜濃縮處理后的濃縮液，其主要理化性狀如下：pH值8.25，電導(dǎo)率10.52 mS·cm-1，總氮含量4.26 mg·mL-1，總磷含量0.16 mg·mL-1，氨氮含量1.53 mg·mL-1，化學需氧量(COD)5.25 g·mL-1。

1.2 水稻秸稈高效腐熟劑篩選

在已滅菌的250 mL錐形瓶中加入秸稈5.000 0 g，然后分別加入0.05 g供試的4種腐熟劑[以不加腐熟劑的作為對照(CK)]、1.5 mL沼液，加入無菌水調(diào)節(jié)含水率至65%，用封口膜封口，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)一段時間(共25 d)。腐解過程中，每隔1 d通過計算質(zhì)量差補充水分，保持含水量。每隔5 d取樣1次，計算分析秸稈腐解率和碳氮比，不同處理每個時間點均設(shè)置5個重復(fù)。

1.3 高效秸稈腐熟劑腐解條件優(yōu)化

對1.2節(jié)得到的腐解效果相對較好的腐熟劑的腐解條件進行優(yōu)化，以溫度、含水量、腐熟劑添加量、濃縮沼液添加量為試驗因子，各因子設(shè)置3個水平，采用Design-expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken方法進行處理設(shè)計(表1)。各處理均設(shè)置5個重復(fù)。試驗體系與1.2節(jié)相似，在已滅菌的250 mL錐形瓶中加入秸稈5.000 0 g，然后按照處理設(shè)計加入相應(yīng)量的腐熟劑和沼液，加入無菌水調(diào)節(jié)含水率，封口膜封口，置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。腐解過程中每隔1 d通過計算質(zhì)量差補充水分，保持試驗設(shè)置的含水量。腐解25 d后，取出樣品測定秸稈腐解率。

表1 Box-Behnken設(shè)計的不同試驗處理及其響應(yīng)值

1.4 秸稈腐解率及碳氮比測定

秸稈腐解率采用失重法測定，秸稈全碳含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定，總氮含量采用混合催化劑法測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

研究數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進行整理，采用SPSS 20.0軟件對不同腐熟劑的腐解率及C/N結(jié)果分別進行單因素方差分析，對有顯著差異的處理采用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腐熟劑對水稻秸稈腐解的影響

圖1 不同腐熟劑對水稻秸稈腐解的影響Fig.1 Effects of different straw-decomposing inoculants on decomposition of rice straw

在溫度為30 ℃、含水量為65%、秸稈腐熟劑用量為0.05 g、濃縮沼液用量為1.5 mL的條件下，不同腐熟劑對秸稈樣品腐解的影響如圖1所示。結(jié)果顯示，秸稈在腐解第5天時，腐解率快速增加至24.8%～34.2%， C/N快速下降。隨著時間推移，腐解速率逐漸變慢。這主要是因為秸稈中大量易分解的有機物，包括淀粉、蔗糖、低聚糖、果糖和氨基酸等，在前期被微生物快速礦化分解[22-23]；而秸稈中的慢分解碳組分，如半纖維素、纖維素、木質(zhì)素和多酚類等，雖然也能夠被微生物代謝利用，但在較短的時間內(nèi)無法實現(xiàn)礦化[24]。相較于不添加腐熟劑的處理，4種腐熟劑的添加均大幅提高了秸稈的腐解率。腐解至25 d，添加腐熟劑的各處理組對秸稈的腐解率均極顯著(P<0.01)高于CK，分別高出14.44、11.67、11.33、10.86個百分點，表明試驗選用的腐熟劑均能有效提高水稻秸稈的腐解率。

對比不同腐熟劑對秸稈的腐解效果，結(jié)果顯示，秸稈腐解至第5天時，腐熟劑A～D對秸稈的腐解率依次為33.1%、26.6%、31.8%和34.2%，其中，腐熟劑A、C和D處理組的腐解率顯著(P<0.05)高于腐熟劑B，表明腐熟劑A、C、D相對于腐熟劑B而言，能在添加后快速實現(xiàn)水稻秸稈的腐解。腐解至25 d時，4種腐熟劑添加后的水稻秸稈腐解率之間無顯著差異，但添加腐熟劑A處理的水稻秸稈C/N顯著(P<0.05)低于其他3個腐熟劑處理，表明腐熟劑A的添加更有利于水稻秸稈后期的腐熟。因此，綜合考慮選擇腐熟劑A用于后續(xù)秸稈腐解條件的優(yōu)化分析。

2.2 響應(yīng)曲面分析

選擇秸稈腐解的溫度、含水量、濃縮沼液添加量、腐熟劑添加量4個因子，采用Box-Behnken進行處理設(shè)計，得到各處理的秸稈腐解率為13.62%～54.55%(表1)。通過多項式回歸分析，對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，建立秸稈腐解的模型方程如下：

R=-56.276 83+3.675 37A+1.140 33B+6.298 67C-66.583 33D+0.008 03AB-0.062AC+9.76AD+0.043 067BC+2.166BD+14.433 33CD-0.088 460A2-0.008 295 6B2-2.388 22C2-2 032.9D2，

(1)

式(1)中：R為秸稈腐解率(%)，A為溫度(℃)，B為含水量(%)，C為濃縮沼液添加量(mL)，D為腐熟劑添加量(g)。

對模型方程進行方差分析，P<0.01，表明本試驗所選用的模型與實測值間能較好吻合(表2)。模型方程失擬項對應(yīng)的F值為0.9，P值大于0.05，說明所得的模型方程對試驗數(shù)據(jù)的擬合度較好，可用此模型來分析和解釋本試驗中所選影響因子對秸稈腐解率的影響。模型方程的決定系數(shù)(R2)值為0.935，說明有93.5%的秸稈腐解率變異分布在所研究的4個因子中，總變異中僅有6.5%不能由模型來解釋；相關(guān)系數(shù)r為0.967，表明實測值與預(yù)測值之間的相關(guān)性較高，誤差較小。

模型的極顯著項(P<0.01)有溫度、含水量和腐熟劑添加量的線性項和平方項，以及濃縮沼液添加量的平方項；方程中的不顯著項(P>0.05)有濃縮沼液添加量的線性項，以及除溫度與腐熟劑添加量的交叉項以外的所有兩因子交叉項。回歸方程中具有多個顯著性平方項，說明響應(yīng)值與4個因素之間具有明顯的非線性關(guān)系。

對式(1)進行分析可知，當溫度、含水量分別為29.6 ℃和90%，腐熟劑和濃縮沼液添加量分別為0.10 g和2.05 mL時，25 d時秸稈的腐解率達到最大值，約為63.25%。

以數(shù)學模型為基礎(chǔ)，通過Design-expert 8.0.6軟件繪制秸稈腐解率與各因素的響應(yīng)曲面(圖2)。秸稈腐解率隨溫度、腐熟劑添加量和含水量的增加而增加。但當濃縮沼液添加量增加時，秸稈腐解率隨溫度的增加先增加后降低，原因可能是較高的溫度容易引起濃縮沼液中氨氮的揮發(fā)，造成氮素損失，進而不能保障微生物在秸稈碳組分分解過程中對氮的需求。隨著腐熟劑和濃縮沼液添加量的增加，秸稈腐解率亦呈現(xiàn)先緩慢增加后降低的變化規(guī)律。這可能是由于濃縮沼液自身含有一定量的有機質(zhì)[25]，當秸稈中的易分解碳組分被微生物利用后，濃縮沼液中的有機質(zhì)亦可為這類微生物提供碳源，促進其生長代謝[26]，但卻對腐熟劑中具有分解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等秸稈有機碳組分的微生物的生長代謝產(chǎn)生了負面影響，進而降低了秸稈最后的腐解率。

表2 回歸模型的方差分析

圖2 兩因素交互作用下秸稈腐解率的響應(yīng)曲面分析Fig.2 Response surface plots showing effects of pairwise interaction of factors on decomposition rate of rice straws

2.3 模型驗證與預(yù)測

使用Design-expert 8.0.6軟件的優(yōu)化功能得到腐熟劑A的秸稈腐解最佳條件：溫度29.6 ℃，含水量90%，腐熟劑添加量0.10 g(相對秸稈質(zhì)量的比例為2.0%)，濃縮沼液添加量2.05 mL(濃縮沼液氮添加量相對秸稈質(zhì)量的比例為0.17%)，預(yù)測此條件下水稻秸稈25 d時的最大腐解率為63.25%。為了驗證模型方程的有效性，在優(yōu)化條件下進行秸稈腐解驗證試驗，結(jié)果如圖3所示。秸稈腐解率隨時間的延長而升高，25 d時秸稈腐解率達62.87%，與預(yù)測值較為接近，表明試驗結(jié)果與模型預(yù)測較為吻合。陳帥等[11]采用單因素試驗研究結(jié)果顯示，水稻秸稈腐解的適宜條件為溫度30 ℃、含水量80%、尿素用量和腐熟劑添加量分別為秸稈質(zhì)量的1.0%和1.0%，在該條件下，25 d時的秸稈腐解率最高可達40.73%，低于本研究所得最佳條件下的秸稈腐解率。這可能是由于相較于尿素，濃縮沼液中豐富的養(yǎng)分、氨基酸、腐殖酸等生物活性物質(zhì)能更有效地促進和保障腐熟劑中功能微生物的生長和代謝，進而提高秸稈的腐解率。由此可見，利用濃縮沼液作為秸稈腐解的外源氮，有助于加速還田秸稈的腐解。

圖3 水稻秸稈腐熟率隨腐解時間的變化Fig.3 Dynamics of rice straw decomposition rate

三角形所在的點分別表示溫度為2、9、14 ℃對應(yīng)的秸稈腐解率。△ represented decomposition rate of rice straw at the temperature of 2， 9， 14 ℃.圖4 水稻秸稈腐熟率隨溫度的變化Fig.4 Variation of decomposition rate of rice straws at different temperatures

相較于外源氮的選擇，在實際的田間應(yīng)用中，溫度條件較難控制。假設(shè)其他因素均在秸稈腐解的最佳條件，模擬不同溫度下添加腐熟劑后25 d水稻秸稈的腐解率(圖4)，結(jié)果顯示：當氣溫在3 ℃以下時，水稻秸稈25 d后腐解率基本為0；溫度高于3 ℃，隨溫度增加，秸稈腐解率快速上升；當環(huán)境溫度超過29.6 ℃后，秸稈腐解率隨溫度上升逐漸降低。該結(jié)果對于實際秸稈還田具有一定的指導(dǎo)意義。以浙江稻-麥種植區(qū)域為例，由于不同水稻品種的熟期差異及雨天的影響，水稻收獲時間有較大的跨度，從10月上旬到12月初不等[27]，這將直接影響水稻秸稈在田間的腐解程度，進而影響下茬作物小麥的播種與生長。以嘉興為例，氣相資料顯示，2017年10—12月的平均氣溫分別為14、9、2 ℃，根據(jù)模型預(yù)測結(jié)果，在最佳腐熟劑、濃縮沼液添加量及含水量條件下，水稻秸稈還田25 d后的腐解率分別為41.6%、25.5%和0。可見，若將水稻收獲期提前至10月，則還田的水稻秸稈可在25 d內(nèi)實現(xiàn)大部分腐解，有效減少對麥播及小麥生長的不利影響。因此，在推進該區(qū)域的水稻秸稈還田時，除了進一步開發(fā)適宜低溫條件的秸稈高效腐熟劑外，還可結(jié)合水稻種植品種的調(diào)整，為秸稈腐熟提供較佳的環(huán)境條件，進而保障秸稈的有效腐解。

3 結(jié)論

本研究使用4種腐熟劑進行處理，其中腐熟劑A(粗纖維降解菌劑)有利于水稻秸稈前期的快速腐解及后期的腐熟，具有相對較好的水稻秸稈腐解效果。采用Box-Behnken設(shè)計和響應(yīng)曲面法分析得到腐熟劑A的最優(yōu)腐解條件：溫度29.6 ℃，含水量90%，腐熟劑和濃縮沼液氮添加量分別為秸稈質(zhì)量的2.0%和0.17%，利用模型方程計算得到25 d時秸稈最佳腐解率的預(yù)測值為63.25%，與試驗驗證結(jié)果62.87%基本吻合。鑒于溫度對秸稈腐熟有較大影響，為更好地提高秸稈腐解速率，推進水稻秸稈還田技術(shù)的廣泛應(yīng)用，可適當考慮通過調(diào)整水稻種植品種、縮短水稻熟期來確保秸稈還田后具有相對較高的環(huán)境溫度，以保障還田秸稈的高效腐解。