小麥黃花葉病毒P3蛋白致病功能域的鑒定和分析

張 巖，亓玉華，魯燕華，楊乾坤，何雨娟，李俊敏，3，陳劍平，3，*

(1.福建農林大學 植物保護學院，福建 福州 350002； 2.浙江省植物有害生物防控國家重點實驗室培育基地，農業農村部/浙江省植保生物技術重點實驗室，浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州 310021； 3.寧波大學 植物病毒學研究所，浙江 寧波 315211)

我國土傳小麥黃花葉病的病原主要為馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)的小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)[1]。WYMV由土壤中的禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)傳播，廣泛分布于我國安徽、河南、江蘇、湖北、陜西、四川和山東等冬小麥區[2]。由于我國的WYMV和國外發現報道的另一種同屬的小麥梭條斑花葉病毒(Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV)十分相似，之前在日本、印度和中國被認為是引起小麥黃花葉病害的第二個病毒[3-5]。1994年Sohn等[6]報道了WSSMV法國分離物RNA1 3’端4 kb序列，1995年于嘉林等[7]報道了一個中國河南分離物RNA1 3’末端的891個核苷酸序列，發現與法國分離物僅有69.9%的序列同源性。隨后，1998年Namba等[8]報道了日本WYMV基因組全長序列，與法國分離物相比，也僅有69.8%的同源性，從而表明它們是不同的病毒，在我國和日本造成小麥黃花葉病的大麥黃花葉病毒屬病毒為WYMV。WYMV在小麥苗期侵染但不顯癥，通常在2月中下旬當氣溫升到6 ℃左右時開始出現癥狀，3月中下旬為發生盛期。氣溫升至15 ℃以上時出現隱癥，20 ℃以上病情會停止發展，但發病對產量造成的損失仍然存在，嚴重影響我國冬麥區小麥的安全生產[2]。

WYMV由RNA1和RNA2兩條正義單鏈線性RNA組成。RNA1全長7 635個核苷酸，只包含一個編碼269 ku的多聚蛋白開放閱讀框(open reading frame，ORF)，經蛋白酶切割后形成8個成熟的蛋白，分別簡稱為P3、7K、CI、14K、VPg、NIa、NIb以及CP[9]。此外，在P3中還可以通過+2移碼產生PIPO蛋白。RNA1的5’和3’末端非編碼區分別為162和258個核苷酸。RNA2全長3 650個核苷酸，整個基因組也僅有一個ORF，編碼一個約100 ku的多聚蛋白，通過切割產生2個成熟的非結構蛋白P1和P2。RNA2的5’UTR和3’UTR分別為171和767個核苷酸[2]。

P3氨基酸序列在馬鈴薯Y病毒科中具有較高保守性，研究表明，P3蛋白在病毒復制[10]、致病性[11-12]、克服宿主抗性[13]、細胞間移動[14-15]等方面均具有重要作用。利用野生型的馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)分離物Tu-3和Tu-2R1構建侵染性克隆，實驗結果表明，交換分離物的P3部分序列后對兩種病毒在甘藍和蘿卜上的癥狀產生顯著影響，表明P3對TuMV在宿主植物上的致病性具有明顯影響[16]。同時，研究表明P3 碳端(P3-C)對馬鈴薯Y病毒屬的內質網(endoplasmic reticum，ER)定位和致病性有決定性作用。木瓜環斑病毒(Papaya ringspot virus，PRSV)的P3-C末端具有ER定位信號，對P3的功能有重要作用[17]。雖然P3在馬鈴薯Y病毒屬中的功能已有較多研究，但大麥黃花葉病毒屬中的P3是否有類似功能目前還未見報道。本研究對WYMV的P3功能進行了初步研究，為進一步深入理解土傳病毒的致病機理提供了新的信息。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：感染WYMV的小麥樣品于本實驗室-80 ℃冰箱保存，RT-PCR檢測確認帶毒情況；野生型本氏煙于本實驗室溫室種植，將小苗移植于營養土∶珍珠巖∶蛭石(體積比)為3∶1∶1的土壤中，24 ℃，光照16 h/黑暗8 h處理條件下培育。

菌株與載體：大腸埃希菌感受態(DH5α)購于南京百思禾生物科技有限公司；農桿菌感受態(GV3101)購于上海唯地生物技術有限公司；煙草脆裂病毒侵染性克隆載體為本實驗室保存菌株。

1.2 試劑

瓊脂糖購于翊圣生物公司；KOD FX Neo高保真擴增酶和Ligation version.2購于TOYOBO公司；Thermosensitive Alkaline Phosphatase和Therno Scientific FastDigestPstⅠ購于fermentas公司；RNA提取試劑：Trizol試劑盒購于賽默飛生物公司，氯仿購于上海凌風化學試劑有限公司；cDNA逆轉錄試劑盒購自天根生物公司；RT-qPCR試劑ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix購于諾唯贊生物公司；DNA Marker、RNA Free H2O、TAE緩沖液等購自上海生工生物公司；乙醇等其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.3 WYMV P3蛋白相關基因克隆

從NCBI下載WYMV P3基因序列(NCBI登錄號AJ131982.1)，根據DNAMAN軟件預測P3基因的跨膜結構域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，分別設計P3和P3碳端(P3-C，位于P3的712-981個核苷酸)、P3-C缺失單個跨膜結構域(P3-C-dN、P3-C-dC)的上下游引物，下劃線為PstⅠ識別位點(表1)。

以Trizol法(具體方法參照Invitrogen公司的RNA提取試劑盒說明)提取WYMV侵染的小麥葉片RNA，通過RT-PCR擴增出P3以及P3-C特異基因片段，割膠回收PCR產物。

1.4 TRV載體構建

將含有沉默載體的質粒按照總體積60 μL體系進行單酶切處理，其中含抽純質粒30 μL，Fast Green Buffer 6 μL，PstⅠ2 μL，其余用ddH2O補足。

其中載體質粒經酶切37 ℃處理30 min后，需加入去磷酸化酶Thermosensitive Alkaline Phosphatase以防止其發生自連，37 ℃再處理30 min后進行切膠回收備用。表達載體總體積15.0 μL，含單酶切目的基因產物6.5 μL，表達載體單酶切產物1.0 μL，Ligation version.2 7.5 μL。于16 ℃連接12 h，將連接產物轉化大腸埃希菌感受態細胞并涂布在含有卡納霉素(Kan，50 μg·mL-1)抗性的平板上篩選陽性克隆，陽性克隆經PCR鑒定后，將含有目的基因的菌液送往擎科生物公司進行DNA測序，獲得重組表達質粒。

1.5 P3及P3-C致病性分析

將測序成功質粒(P3、P3-C、P3-C-dN、P3-C-dC)使用電擊法轉化到農桿菌GV3101菌株，2 d后經菌落PCR鑒定成功后挑取單菌落搖菌，集菌后用緩沖液(10 mmol·L-1pH 5.8的MES、10 mmol·L-1MgCl2和200 μmol·L-1乙酰丁香酮)重懸農桿菌沉淀，28 ℃靜置2 h注射9或10葉期的本氏煙。注射后持續觀察煙草癥狀表現。

表1 引物列表

P3為完整蛋白，P3-C為P3的712-981個核苷酸，P3-C-dN和P3-C-dC分別為P3-C缺失N段的跨膜結構域和缺失C端的跨膜結構域片段。

P3 indicated the complete protein; P3-C indicated the region of 712-981 of P3; P3-C-dN indicated the transmembrane domain of P3-C with N-terminal deletion; P3-C-dC were the transmembrane domain of P3-C with C-terminal deletion.

1.6 P3-C移碼突變

將WYMV P3-C肽段中第一個翻譯起始密碼子ATG之后的第一個堿基進行缺失突變，使后續的氨基酸發生移碼突變。利用移碼突變后的P3-C基因序列構建TRV重組載體，經農桿菌浸潤后，持續觀察本氏煙的癥狀。

1.7 P3-C跨膜結構域突變

為了研究P3-C兩個跨膜結構域(TMD1和TMD2)對P3-C功能的重要性，我們將TMD1和TMD2中的重要氨基酸用脯氨酸替代，從而破壞跨膜結構域的功能。突變被設計為減少TMD的疏水性，將TMD1中的2個亮氨酸以及一個酪氨酸(LLY)，TMD2中異亮氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸以及亮氨酸(IYFL)分別用連續的脯氨酸替代產生mP3-C突變體。另外，我們同時設計了分別缺失TMD1和TMD2的2個突變體，命名為P3-C-dN和P3-C-dC。利用突變后的基因序列分別構建TRV重組載體，經農桿菌浸潤后，持續觀察本氏煙的癥狀。

2 結果與分析

2.1 WYMV P3及P3-C基因克隆與序列分析

為獲取P3及P3-C目的片段，從WYMV侵染的小麥葉片中提取總RNA，RT-PCR擴增得到了WYMV P3(TRV-WYMV-P3-F/R)及P3-C(TRV-WYMV-P3-C(712)-F/P3-R)cDNA片段(圖1-A)，割膠回收PCR產物并將其分別構建到PstⅠ酶切的TRV載體上，PCR檢測并挑取陽性克隆送測。測序結果表明，P3基因全長由981個核苷酸組成，共編碼327個氨基酸，P3-C核苷酸長度為270，編碼90個氨基酸。通過NCBI BLAST同源比對明確了擴增的確實為WYMV P3序列。經DNAMAN蛋白質跨膜結構域分析發現，P3編碼的蛋白氨基酸含有多個疏水性區域，且含有3個跨膜結構域，P3-C(712-981)含有兩個跨膜結構域(圖1-B)。

2.2 WYMV P3-C在本氏煙上具有致病效應

將P3及P3-C成功構建到TRV載體后，與TRV-RNA1農桿菌共浸潤本氏煙植株。結果表明，農桿菌浸潤5 d后，與對照組相比，TRV-P3-C在浸潤煙草2 d時(圖2-A、D)，接種葉即開始出現萎蔫失水，接種后4 d接種葉片壞死且緊挨接種葉的莖部開始萎蔫壞死(圖2-B、E)，接種5 d整個莖部進入失水萎蔫壞死狀態，植株已無法正常生長發育，直至整株植物死亡(圖2-F)。有意思的是，構建的P3全長載體TRV-P3與對照組相比則沒有明顯表型差異，均未引起本氏煙致病表型(圖2-C)。

2.3 P3-C的致病有效因子為多肽

由于P3-C致病性可能由病毒來源的小干擾RNA或病毒編碼的多肽引起，為進一步明確P3-C致病性是否由P3-C編碼的氨基酸引起，我們將P3-C進行移碼突變，并命名為P3-C-FM(圖3-A)。通過農桿菌侵染本氏煙5 d后觀察癥狀，結果表明移碼突變后的P3-C(即P3-C-FM)和對照癥狀類似，無法在本氏煙上引起P3-C的萎蔫壞死表型(圖3-D)，表明P3-C的致病性確實是由其編碼的氨基酸引起的。

M，DNA marker；泳道1，WYMV P3；泳道2，WYMV P3-C。M， DNA marker; Lane 1， WYMV P3; Lane 2， WYMV P3-C.圖1 RT-PCR擴增結果(A)及P3編碼的氨基酸序列分析和跨膜結構域預測(B)Fig.1 RT-PCR results (A) and sequence analysis of P3 protein and prediction of its transmembrane domains (B)

A-B，TRV-GUS分別侵染煙草2和5 d癥狀圖，作為陰性對照；C，TRV-P3癥狀圖；D-F，TRV-P3-C分別侵染煙草2、4和5 d癥狀圖。A-B， Symptoms of N. benthamiana induced by expression of GUS gene(negative control) for two and five days after injection; C， Symptoms of TRV-P3; D-F， Symptoms of N. benthamiana induced by expression of P3-C for two， four and five days after injection.圖2 TRV分別表達WYMV P3和P3-C在本氏煙上引起的癥狀Fig.2 Symptoms of N. benthamiana induced by expression of WYMV P3 and P3-C in a TRV vector

2.4 跨膜結構域對WYMV P3-C的致病性具有重要作用

為研究P3-C兩個跨膜結構域(TMD1和TMD2)對P3-C功能的重要性，我們將P3-C中兩個跨膜結構域中疏水性氨基酸用脯氨酸替代，重新構建TRV-mP3-C重組載體(圖4-A)。同時，我們還將兩個跨膜結構域分別單獨缺失，構建突變體TRV-P3-C-dN和TRV-P3-C-dC(圖4-A)。農桿菌浸潤后持續觀察本氏煙上引起的癥狀，結果表明，浸潤5 d后無論是TRV-mP3-C還是TRV-P3-C-dN/TRV-P3-C-dC均和對照類似，無明顯癥狀，不具備致病性(圖4-B)，表明這兩個跨膜結構域對WYMV P3-C的致病性均有十分重要的作用。

3 討論

植物病毒編碼的復制酶、運動蛋白、外殼蛋白等均有可能是病毒的致病因子，多種植物病毒中曾報道過復制酶導致的寄主致病性[18]。同時有研究表明，寄主RNA干擾產生的病毒來源的小干擾RNA除剪切病毒自身基因組外，也可能靶向寄主內源性靶標并對其進行轉錄后水平調控，導致寄主癥狀的產生[19-20]。由于WYMV在小麥上的研究缺乏反向遺傳學工具，同時禾谷多黏菌傳毒體系在室內建立較困難，因此目前WYMV的相關研究進展較慢。本研究利用TRV介導的本氏煙基因沉默系統，明確了WYMV的P3碳端在本氏煙上具有致病相關功能域P3-C，且其致病性是由多肽引起的，同時其兩個跨膜結構域對致病性具有重要作用，有助于后續對WYMV致病機理的深入研究。本研究發現，P3-C在本氏煙上有致病活性，而完整P3蛋白則不具備，推測是由于P3-C比P3缺少一個跨膜結構域，P3-N端的區域在結構上可能會掩蓋P3-C端的致病能力，這一推測還有待進一步實驗驗證。

A，P3-C移碼突變示意圖；B，TRV-GUS為陰性對照；C，TRV-P3-C為陽性對照；D，TRV-P3-C移碼突變(TRV-P3-C-FM)癥狀圖。A， Schematic diagram of P3-C frame shift mutation; B， TRV-GUS was used as a negative control; C， TRV-P3-C was used as a positive control; D， TRV-P3-C frame shift mutation (TRV-P3-C-FM) symptom.圖3 移碼突變示意圖及煙草癥狀圖Fig.3 Schematic diagram of frame shift mutations and the symptoms of infected N. benthamiana

A，P3-C跨膜結構域突變示意圖；B，TRV-GUS為陰性對照；C，TRV-P3-C為陽性對照；D、F，P3-C跨膜結構域突變癥狀圖。A， Schematic diagram of P3-C frame shift mutation; B， TRV-GUS was used as a negative control; C， TRV-P3-C was used as a positive control; D-F， P3-C transmembrane domain mutation symptom.圖4 跨膜結構域突變示意圖及煙草癥狀圖Fig.4 Schematic diagram of transmembrane domain mutations and the symptoms of N. benthamiana

先前研究表明，P3氨基酸序列在馬鈴薯Y病毒屬中具有較高保守性，P3氨基酸序列在WYMV不同分離物中也具有很高保守性(未發表數據)，這可能和P3在病毒侵染過程中具有多種重要功能有一定關系。已有研究表明，P3蛋白除了對宿主具有致病性外，其在病毒的復制[10]，克服宿主抗性[11-12]，細胞間移動[14-15]等方面均有重要功能。與WYMV同一家族中的不同病毒相比，不同病毒編碼的P3在寄主內的亞細胞定位有所不同。如煙草葉脈斑點病毒(Tobacco vein mottling virus，TVMV)的P3蛋白與CI蛋白在寄主的細胞質中發生相互互作[21]，而煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus，TEV)的P3蛋白則在細胞核內與病毒編碼的NIb和NIa蛋白發生互作[22]。這些現象表明，不同病毒的P3蛋白可能在寄主中發揮不同功能，而WYMV病毒P3蛋白在寄主內的亞細胞定位情況及發揮的生物學功能還有待進一步的探索研究。