新型鴨呼腸孤病毒在DF-1細胞系中的增殖特性

云 濤，華炯鋼，葉偉成，倪 征，陳 柳，張 存

(浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所， 浙江 杭州 310021)

禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)是呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬中的一員，為雙鏈RNA，有10個節段，常見于雞、火雞、鴨、鵝及一些鳥類等宿主體內[1]，以病毒性關節炎、腸道病、腱鞘炎、矮小綜合征、免疫抑制性疾病及吸收不良綜合征等為臨床特征[2]。1997年以來，在我國福建、浙江等地雛番鴨中暴發番鴨呼腸孤病毒(classical duck reovirus，CDRV或Muscovy duck reovirus，MDRV)疫病，其臨床病變特征為肝脾腫脹，肝脾表面覆有大量的白色壞死點，俗稱番鴨“白點病”，該疫病的出現及流行給我國番鴨養殖業帶來了較嚴重的經濟損失[3-4]。

近年來，我國養鴨主產省份鴨、鵝群中暴發一種以肝、脾出現大量壞死灶為主要特征的新疫病，根據臨床病理特征被命名為“出血性壞死性肝炎”和“脾壞死病”[5-11]。該病無明顯季節性，發病以5～10日齡為主，多品種鴨(如番鴨、半番鴨、麻鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨等)和鵝均可發生[12-16]。該疫病不僅引起雛鴨發病和死亡，還可引起免疫抑制和生長發育障礙[6，11，17-18]。經病原分離與鑒定、全基因組序列破譯與分析及系統進化樹分析證實，該病原是一種新型的鴨呼腸孤病毒(new-type duck reovirus，NDRV)，屬于呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬Ⅱ型的禽正呼腸孤病毒種成員[11-15]。

盡管CDRV和NDRV都屬于禽正呼腸孤病毒群成員，兩者的生物學特性有很多相似性，但在致病性和抗原性上存在顯著的差異。在致病性方面，NDRV除可致死番鴨胚(僅用于分離CDRV)外，還可致死雞胚和肉鴨胚，體外分離胚的種類增加[6，11，12，16]；其次，NDRV除可引起番鴨和半番鴨致病(CDRV致病譜)外，還可引起多個品種的鴨及鵝致病，致病譜擴大[6，9-17]；再者，NDRV主要引起肝、脾表面出現大量不同規則的出血斑和壞死灶，而CDRV主要引起肝、脾腫脹，表面覆有大量白色的壞死點[6，11，12，16]。在抗原性方面，血清交叉中和試驗表明，CDRV與NDRV之間的抗原相關性低[7]。此外，CDRV與NDRV基因組的SDS-PAGE電泳圖譜不同，CDRV為3/3/4圖式，而NDRV為3/3/1/3圖式[6，11，13，19]。與CDRV相比，NDRV的宿主范圍更廣、致病性更強。

雖然對CDRV的研究已經足夠深入，國內也已有預防CDRV的商品化疫苗，但NDRV與CDRV之間在致病性、宿主特異性、抗原性及蛋白編碼基因等方面存在差異[6，11-19]。目前并沒有行之有效的預防與控制NDRV疫病的方法與技術。所以，研制能夠預防NDRV的疫苗意義重大。本文旨在研究NDRV JDM10毒株在DF-1細胞中的增殖特性，并為進一步開展NDRV細胞滅活苗研制及分子致病機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株與細胞系

NDRV JDM10毒株由浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所禽病研究室分離鑒定并保存，DF-1細胞系由浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所禽病研究室保存。

1.1.2 主要試劑

DL 2 000 DNA Marker，Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0，PrimeScriptTMOne-step RT-PCR Kit Ver.2，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，pMD-T19 simple載體，寶生物工程(大連)有限公司；FITC和HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗，北京中衫金橋生物技術有限公司；胎牛血清、DMEM培養基， 美國Gibco公司；抗NDRV σC單克隆抗體由浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所禽病研究室制備并保存。

1.2 方法

1.2.1 病毒接種DF-1細胞

取融合度達80%的單層DF-1細胞，用pH=7.0無菌PBS緩沖液清洗3次，加入種毒液作用吸附2 h，棄去吸附液，用含2% 胎牛血清的DMEM維持液替換，37 ℃、5% CO2培養箱中培養，用光學顯微鏡觀察細胞病變情況。培養3 d后，收取細胞培養物，凍融3次收病毒，記為F1，-80 ℃冰箱中凍存備用。用F1毒接種DF-1細胞，并收取培養3 d后的細胞培養物F2，重復接毒3次，收集第3代細胞培養物F3。測定病毒效價。

1.2.2 引物設計與合成

根據NCBI上公布的NDRV JDM10株SigC基因的核苷酸序列(登錄號：KF154116)，用Oligo 6.0設計特異性引物，并由上海博尚生物技術有限公司合成。上游引物F: 5′-ACGATGGATCGCAACGAGGTG-3′，下游引物R: 5′-GATGAATAGCTCTTCTCATCGC-3′，擴增產物片段為1 001 bp。

1.2.3 RT-PCR檢測

收取F3病毒液，提取病毒RNA， NDRVSigC基因特異性引物進行一步法RT-PCR擴增。擴增條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環。RT-PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 間接免疫熒光檢測

將DF-1細胞培養于35 mm培養皿中，接種F3代病毒液。培養24 h后，將培養皿中的細胞液棄除，用pH=7.0無菌PBS細胞緩沖液清洗3次，然后用預冷的丙酮：甲醇體積比為1∶1的固定液4 ℃固定30 min；用含1% NP40的PBS細胞緩沖液洗3次，加入抗NDRV-σC 單克隆抗體A9-D4(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h；用NP40-PBS 洗3次，加入羊抗鼠的FITC-IgG為二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h。在熒光顯微鏡下進行檢測。

1.2.5 Western-blot檢測

將NDRV JDM10毒株感染72 h的細胞培養物裂解后，經SDS-PAGE電泳后，轉印至PVDF膜，用含5%脫脂乳的PBST溶液4 ℃封閉過夜，以抗NDRV-σC 單克隆抗體A9-D4(1∶5 000)為一抗，羊抗鼠的HRP-IgG為二抗(1∶5 000)，37 ℃各孵育1 h。通過DAB法進行顯色檢測。

1.2.6 一步生長曲線

將收取的F3病毒液接種DF-1細胞，于接毒后2、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h收取細胞培養物，-80 ℃凍存備用。將DF-1細胞接種到96孔細胞板，37 ℃ 5% CO2培養箱中過夜培養，病毒液進行10倍比稀釋，按照每孔100 μL分別接種于病毒稀釋液，37 ℃作用2 h，棄去病毒液，更換含2% FBS的DMEM維持液，37 ℃、5% CO2培養箱中培養觀察致病變效應，記錄各稀釋度孔出現致病變效應的孔數(每個時間點病毒液測定3次)。采用Reed-Meunch方法計算10個時間點各病毒液的TCID50，以3次重復實驗結果的平均值為最終值，并繪制病毒在細胞上的一步生長曲線。

2 結果與分析

2.1 細胞形態學觀察

如圖1所示，DF-1細胞在接種病毒的12 h后可觀察到細胞病變，72 h時能觀察到細胞破碎、萎縮、抱團、脫落，個別細胞出現空泡、邊緣模糊、胞體變大，甚至死亡等特征病變。對照組細胞則生長良好。

2.2 RT-PCR檢測

由圖2可知，成功擴增出一條大小為1 001 bp的條帶，而陰性對照無條帶。對該片段進行測序分析，該擴增片段序列與NDRV JDM10毒株基因組序列的同源性在99.99%以上，說明NDRV JDM10毒株在DF-1活細胞中進行了增殖。

M，DL2 000 DNA Marker；1～2，RT-PCR擴增產物；3，陰性對照。M， DL2 000 DNA Marker；1-2， RT-PCR products；3， Negative control.圖2 RT-PCR擴增產物鑒定Fig.2 RT-PCR amplification product identification

2.3 間接免疫熒光檢測

NDRV JDM10在接種DF-1細胞24 h，以抗NDRV-σC單克隆抗體為一抗，以羊抗鼠FITC-IgG為二抗，進行間接免疫熒光檢測。結果顯示，DF-1細胞內有大量的特異性綠色熒光(圖3)，表明NDRV σC蛋白獲得了良好的表達，且NDRV JDM10毒株能在DF-1細胞中增殖。

2.4 Western-blot檢測

如圖4所示，在細胞裂解物中能檢測到分子量大小為34 ku的蛋白，與DNRV σC蛋白大小一致，且與抗NDRV σC單抗產生特異性免疫反應(圖4)，表明NDRV JDM10毒株能在DF-1細胞中增殖。

A，正常DF-1細胞；B，接種病毒24 h后的DF-1細胞。A， Normal DF-1 cells；B， Cell of DF-1 infected with NDRV JDM10 for 24 h.圖3 NDRV-σC在DF-1細胞中表達的間接免疫熒光檢測Fig.3 Detection of NDRV-σC expression in DF-1 cells with IFA

M，蛋白質分子質量標準；1，感染NDRV的DF-1細胞裂解物；2，正常DF-1細胞裂解物。M， Protein molecular weight marker; 1， DF-1 cells infected with NDRV; 2， Normal DF-1 cells.圖4 NDRV σC蛋白的Western-blot檢測Fig.4 Detection of NDRV σC by western-blot

2.5 一步生長曲線

將收取的F3病毒液接種DF-1細胞，于接毒后2、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h收取細胞培養物，分別測定TCID50(每個時間點重復3次后取平均值)，各時間點的TCID50分別為10-1.39、10-3.29、10-5.50、10-6.64、10-7.39、10-7.80、10-7.80、10-7.90、10-7.75、10-7.80·(0.1 mL)-1。經GraphPad Prism軟件分析后繪制出一步生長曲線(圖5)可知，NDRV JDM10毒株在接種DF-1細胞后，0～12 h為潛伏期，12～48 h為快速增長期，48 h后為穩定期，但在72 h病毒效價達到峰值，TCID50為10-7.90·(0.1 mL)-1，之后病毒效價維持在較高水平。

圖5 NDRV JDM10毒株在DF-1細胞上的增殖動力曲線Fig.5 One step growth curve of NDRV JDM10 in DF-1 cells

3 討論

近年來，我國養鴨主產省份及地區均相繼暴發了新型鴨呼腸孤病毒病疫情，該病較以往疫情致病性更強，宿主范圍更廣，流行的疫區也逐年擴大，已給我國養鴨業造成了嚴重的經濟損失，并成為一類重要傳染病原，嚴重阻礙養鴨業的健康發展[10，17]。

研究發現，ARV、CDRV和NDRV均具有較廣的細胞親嗜性，可在Vero細胞、雞胚成纖維細胞(CEF)、倉鼠腎細胞(BHK-21)、犬腎細胞(MDCK)、番鴨胚成纖維細胞(MDEF)、Vero細胞、AD293T細胞、Marc-145細胞等多種細胞系中增殖，并產生穩定病變[7，20]。而三者致細胞病變特征有所差異，ARV與NDRV均以巨融合為主，CDRV則以細胞圓縮壞死為主，且三者之間的抗原相關性較低，細胞培養特性也不盡相同[7，20]。沈文康等[21]在Vero細胞中接種ARV S1133，丁明洋等[22]在BHK-21細胞中接種NDRV TH11后結果均發現，ARV S1133和NDRV TH11等2種不同的病毒株在接種細胞后均可分為潛伏期、快速增長期和穩定期3個時期，且12 h時病毒效價最低，48 h時病毒效價達到峰值。Vero細胞和BHK-21雖是傳代細胞系，已被廣泛用于疫苗研制，但這2種細胞系均為哺乳動物細胞系，與禽類遺傳關系甚遠，用其生產的疫苗免疫家禽時可產生明顯的副反應。

胚接種病毒是目前禽類病毒分離與增殖最常用的方法，雖然該方法有效、單次獲毒多，但周期長、操作繁瑣、容易污染的缺點，使得對病毒的分離培養有很大的局限性。為此，本研究利用DF-1細胞研究NDRV的增殖規律，充分利用了細胞增殖病毒周期短、可收獲單一病毒等多種優點。DF-1細胞是一種可傳代的雞成纖維細胞系，是一種穩定的、無腫瘤基因、自發無限增殖的細胞系，已被廣泛用于動物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領域，是生命科學領域重要的病毒轉染、培養生物材料[23]。本研究利用DF-1細胞研究NDRV在細胞中的增殖特性，結果表明，NDRV能在DF-1細胞中有效增殖，并產生明顯的致病變效應。但NDRV JDM10在DF-1細胞上傳至一定代數后才出現細胞融合現象，在此之前與CDRV引起的致病變效應相同。一步生長曲線用來定量描述病毒生長規律，可劃分為3個時期，即潛伏期、突破期、穩定期[16-17]。NDRV JDM10毒株在DF-1生長也可分為3期，0～12 h為潛伏期， 12～48 h為快速增長期，48 h之后為穩定期，侵染細胞2 h時病毒就可增殖，72 h病毒效價達到峰值，病毒在細胞中的增殖趨勢與上述報道結果基本一致。本研究發現，NDRV在DF-1細胞中可有效增殖，72 h病毒效價達到峰值，TCID50為10-7.90·(0.1 mL)-1。本研究為應用DF-1細胞研制NDRV細胞滅活疫苗和開展該病毒的分子致病機理研究提供了一個良好的操作平臺。