地膚通乳散治療奶牛乳房炎臨床療效及作用靶點預測

白東東，李新圃，楊 峰，羅金印，王旭榮，李宏勝

(中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農業農村部獸用藥物創制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

奶牛乳房炎嚴重影響奶牛產業發展，其病因非常復雜，是奶牛自身、病原微生物及環境共同作用導致的結果。其中，病原微生物感染，尤其是大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌3種致病菌感染是導致奶牛乳房炎發生、發展的主要原因[1-2]。奶牛乳房炎每年可造成高達350億美元的經濟損失，僅美國1年的損失就高達20多億美元。國內外學者對該病進行了系統的研究，但由于乳房炎的復雜性，迄今為止，還沒有研制出能徹底根除金黃色葡萄球菌﹑無乳鏈球菌和大腸埃希菌引起的乳房炎的藥物[3]。目前，對奶牛乳房炎的治療還是以抗生素治療為主，雖然有一定的效果，但由于抗生素的濫用，造成乳汁中藥物殘留及細菌耐藥性等問題[4]。中獸藥因其具有抗菌[5]、消炎[6]、提高免疫力[7]等藥效，而且低毒、低殘留、療效確切，成為國內外學者研究的焦點。近年來，用網絡藥理學揭示中藥作用機制的研究越來越多，如中藥治療冠心病[8]、抑郁癥[9]等，而中獸醫在這方面的研究還較少[10-11]。利用網絡藥理學可以從藥物、靶點、疾病整體來分析、挖掘藥物信息，具有整體性和系統性的特點，與中獸醫學的整體觀念不謀而合，因而在基礎研究方面具有非常可觀的應用前景。

本試驗首先選用由蘭州畜牧與獸藥研究所奶牛疾病創新團隊研發的地膚通乳散對奶牛乳房炎主要病原菌進行體外抗菌活性的測定，然后對臨床患有奶牛乳房炎的奶牛進行治療，觀察治愈率、有效率等指標，最后利用網絡藥理學方法揭示其作用機制，為后續深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

患有乳房炎的奶牛選自甘肅省某牛場，共38頭。

1.1.2 試驗菌株

本試驗菌株為蘭州畜牧與獸藥研究所微生物與免疫課題組提供。質控菌：金黃色葡萄球菌標準株(ATCC29213)；臨床分離菌株：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和無乳鏈球菌。

1.1.3 試劑

營養肉湯培養基(廣東環凱生物科技有限公司)，環丙沙星(上海源葉生物有限公司產品)，地膚子、蒲公英等4味中藥購自蘭州市黃河藥材市場。

1.1.4 儀器

GHP-9050隔水式培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)，超凈工作臺(上海力申科學儀器有限公司)，LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)，微量移液槍(德國Sartorius公司)，電子天平(諸暨市超澤衡器設備有限公司)，J6-HC高速冷凍離心機(美國Backman公司)，HZQ-F100恒溫振蕩培養箱(哈爾濱市東聯生化儀器有限公司)。

1.2 藥敏試驗

1.2.1 中藥藥液的制備

取地膚子、蒲公英等4種藥材共500 g，加10 L蒸餾水浸泡30 min，煎煮1 h，4層紗布過濾，再加蒸餾水5 L，煎煮30 min，過濾，合并2次濾液，5 000 r·min-1離心30 min，取上清液濃縮至1 g·mL-1，裝入生理鹽水瓶中，105 ℃ 20 min高壓蒸汽滅菌，分裝到50 mL的離心管中4 ℃保存。

1.2.2 菌液的制備

將質控菌和臨床分離菌各20 μL分別接種到4個2 mL營養肉湯試管中，37 ℃ 120 r·min-1振蕩培養12 h，取出后加入生理鹽水稀釋到1.5×108CFU·mL-1，再用營養肉湯稀釋1 000倍，菌液中菌濃度為1.5×105CFU·mL-1。

1.2.3 最小抑菌、殺菌濃度測定

準備好一定量的96孔板，分別在第1、12列中加入180、200 μL培養基，第2～11列中加入100 μL培養基。在第1列中加入地膚通乳散提取物和陽性對照藥20 μL，用排槍充分混勻，然后將100 μL轉移到第2列，混勻后再吸100 μL轉移到第3列，以此類推到第10列，之后將其稀釋至1.5×105CFU·mL-1的細菌液，每孔100 μL添加到第1～10列，此時96孔板中第1～10列中地膚通乳散提取物終濃度分別為50.00、25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 mg·mL-1，陽性對照藥環丙沙星的終濃度分別為5.12、2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01 μg·mL-1。將96孔板置于37 ℃恒溫培養箱中培養12～36 h，觀察并記錄最低抑菌濃度。當環丙沙星對標準菌株ATCC29213的最小抑菌濃度在規定的范圍內時(0.12～0.5 μg·mL-1)，表明細菌液的濃度是合適的。

1.3 臨床試驗

患病奶牛每日灌服1 000 g地膚通乳散，連續灌服3～5 d，根據臨床癥狀判斷其療效。若奶牛乳汁中絮狀物消失，乳房腫脹消失，乳產量恢復正常，乳房觸溫正常，則為治愈；若奶牛乳汁中絮狀物減少，乳房腫脹程度減輕，產奶量有所提高，則為好轉；若奶牛癥狀無變化或絮狀物增多、乳汁顏色變黃，難以擠出，乳房腫脹更加明顯，甚至乳房中出現硬塊等癥狀更加嚴重，則為無效。有效率為治愈率與好轉率之和。若患病奶牛在治療期間治愈，則停止給藥，轉入正常群；若在治療結束后患病奶牛未治愈或無效，則改用其他藥物治療。

1.4 地膚通乳散治療奶牛乳房炎作用靶點預測分析

利用BATMAN數據庫檢索地膚通乳散各味藥所有化學成分，打分值設置為≥55，P值<0.05。將篩選出符合條件的地膚通乳散的活性化合物及其對應靶點通過Cytoscape 3.5.0軟件構建地膚通乳散化合物—靶點網絡圖，在NCBI數據庫檢索“Bostaurus”和“Mastitis”，獲取奶牛乳房炎相關的靶點(見表1)，將其和地膚通乳散靶點一起上傳于STRING 10.5軟件，物種選擇為“Bostaurus”，下載互作關系后將數據上傳于Cytosacpe軟件中的Cytohubba插件中，即得到地膚通乳散于奶牛乳房炎PPI網絡圖前10的關鍵靶點，進行分析。

表1 牛乳房炎靶點

續表1

2 結果與分析

2.1 藥敏試驗結果

由表2可知，環丙沙星對金黃色葡萄球菌標準株ATCC29213的最小抑菌濃度為0.16 μg·mL-1，表明細菌數量符合要求。地膚通乳散可抑制、殺滅奶牛乳房炎病原菌，其中對無乳鏈球菌的效果最好，最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)均為1.52 mg·mL-1；對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC稍差，為25 mg·mL-1，MBC是MIC的2倍。

2.2 地膚通乳散治療奶牛乳房炎的臨床功效

經地膚通乳散治療后，38頭患病奶牛中，24頭治愈，治愈率63.16%，10頭奶牛癥狀好轉，有效率可達89.47%。患病奶牛連續治療3 d就會出現好轉，絮狀物消失、紅腫減輕等，治療無效的奶牛癥狀一般會更加嚴重，轉為以熱毒為主的乳房炎，此時再治療應以清熱瀉火、消腫止痛為主，加金銀花、連翹、菊花等。

2.3 地膚通乳散治療奶牛乳房炎作用靶點預測

利用BATMAN數據庫中檢索地膚通乳散所有化合物，并進行篩選，共得到21個活性化合物，對應靶點173個，化合物—靶點網絡圖見圖1。通過Cytoscape軟件可知，連接靶點大于20個的化合物有三十烷醇、莎草薁酮、廣藿香酮、香附子烯、β-蛇床烯、二烯(表3)；連接活性化合物大于3個的靶點有SNW結構域蛋白1、維生素D結合蛋白前體、25-羥基維生素D-1-羥化酶、維生素D3受體和雄激素受體(表4)。

表2 地膚通乳散對3種病原菌的抗菌活性

三角形表示化合物，圓形表示靶點。The triangle represented the compound， circular represented the target.圖1 地膚通乳散化合物—靶點網絡Fig.1 Compound-target network of Difutongrusan

將地膚通乳散活性化合物靶點與奶牛乳房炎靶點上傳于Cytoscape軟件中，利用cytoHubba插件對篩選出的樞紐靶點進行分析，結果見圖2。

從圖2可以看出，篩選出的樞紐靶點包括5’-核苷酸酶前體(5′-nucleotidase precursor，NT5E)、白介素-8(interleukin-8，IL8)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit α isoform，PIK3CA)、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基β(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit β isoform，PIK3CB)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Janus激酶2(janus kinas2，JAK2)、Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)，原癌基因RelA，NF-κB亞基和趨化因子CXCL12。故預測地膚通乳散可能通過NT5E、IL8、ESR1、PIK3CA和PIK3CB作用于TNF、JAK2、TLR4、原癌基因RelA、NF-κB亞基和趨化因子CXCL12來治療奶牛乳房炎。

表3 地膚通乳散的靶點連接度大于20的化合物信息

表4 地膚通乳散連接活性化合物連接度大于3的靶點

圖2 地膚通乳散治療奶牛乳房炎的樞紐靶點Fig.2 Core targets of Difutongrusan in the treatment of bovine mastitis

3 討論

本研究根據中獸醫理論組方配伍為地膚通乳散，先對其抗菌活性做了體外試驗，然后對患乳房炎奶牛進行治療，進行治愈率、有效率統計，最后應用BATMAN數據庫，STRING、CytoScape軟件等篩選出地膚通乳散4種活性成分及相應作用靶點，構建和分析化合物—靶點網絡等對地膚通乳散治療奶牛乳房炎作用機制。

地膚通乳散對奶牛乳房炎主要病原菌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的抗菌活性較好，但藥敏試驗僅能證明中藥復方體外的抗菌活性。奶牛乳房炎的病因復雜，與奶牛機體、環境和病原微生物均有關系，單從抗菌活性角度來評價藥物的臨床療效太單一，故可在臨床上篩選患氣血瘀滯型乳房炎奶牛進行治療，觀察臨床效果。本研究結果表明，應用地膚通乳散治療患乳房炎奶牛，治愈率為63.1%，有效率為89.47%。本試驗中，治愈率、有效率與治療奶牛頭數、治療天數和天氣等原因有關，故待后期提取、給藥量、給藥天數優化后可能會取得更好的臨床效果。

利用數據庫對地膚通乳散治療奶牛乳房炎作用位點進行分析后發現，地膚通乳散可能主要通過三十烷醇、莎草奧酮、廣霍香酮、β-蛇床烯和二烯等的靶點5’-核苷酸酶、白介素-8、雌激素受體1、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基β等作用于腫瘤壞死因子、Janus激酶2、Toll樣受體4、原癌基因RelA、NF-κB亞基和趨化因子CXCL12來治療奶牛乳房炎。據有關報道，5’-核苷酸酶對肝膽疾病的診斷有較高的特異性[12]，白介素-8可起到抗感染和免疫損傷的作用，患有乳房炎的奶牛血清白介素-8極高于健康奶牛[13]，雌激素受體1也與奶牛泌乳[14]及多種炎癥有關。故在后續進一步的臨床研究中，可合理設計試驗，利用抗體芯片、ELISA等方法檢測治療前后和健康奶牛白介素-8，雌激素受體1等相關靶點的相對含量，用來驗證其預測結果。

利用網絡藥理學可以在一定程度上揭示中藥復方治療人類或動物疾病的活性化合物、作用靶點等，但也存在一定的局限性，從大數據庫采集的活性化合物在實際中藥劑型中不能全部檢測出，即存在“量”的問題，故要使預測結果更加接近實際，應在中藥復方確定劑型后檢測出可檢測到的化合物，再結合口服利用度和類藥性篩出活性化合物進行靶點、機制預測，這樣結果更具有說服力。