22份苜蓿種質萌發期耐鹽性綜合評價

李明雨，王 焱，梁丹妮，姚亞妮，蘭 劍，4，*

(1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021； 2.蘭州大學 草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020； 3.固原市原州區農村實用技術培訓中心，寧夏 固原 756000； 4.寧夏大學 現代草業工程技術研究中心，寧夏 銀川 750021)

土壤鹽漬化是影響植物生長和分布、導致作物產量降低的一個重要環境因子，目前已成為農業發展所面臨的一個難題。我國鹽漬土地面積約為9 913.3萬 hm2，分布廣，類型多，且存在大量潛在鹽漬化土地[1-2]。鹽脅迫會造成種子萌發推遲、種苗死亡、生長發育受阻、產量降低，嚴重影響了農業生產[3]。近年來，人口不斷增長，資源短缺和環境惡化等問題不斷加重，因此，改良和利用鹽漬土地方面的研究成為當前的熱點之一[4]。目前，篩選耐鹽草種進行推廣種植被認為是改良利用鹽漬土的重要途徑之一[5]。

苜蓿(Medicagosativa)被稱為牧草之王，其高產穩定、適應性廣、營養價值高、適口性好，是優良草種的典型代表[6]，全世界種植面積已達3 330萬 hm2。但目前苜蓿產業發展中存在諸多制約因素，其中困擾苜蓿產業發展的主要問題之一是苜蓿品種的選擇[7]，而在苜蓿品種選擇時首先要考慮其品種的生態適應性，因此對苜蓿種質的耐鹽性進行研究和評價至關重要，近年來國內外學者對苜蓿耐鹽性的研究較多。王榕楷等[8]研究表明，植物的耐鹽性隨其發育階段變化而變化。Mccoy[9]認為，紫花苜蓿耐鹽基因的表達隨生長時期的變化而變化，因而對其耐鹽性進行研究應分不同階段。而Al-Khatib[10]的研究表明，紫花苜蓿在萌發期和苗期對鹽的敏感性較生長后期大，因此種子萌發期是耐鹽性研究的重要時期，萌發期的耐鹽狀況可反映該物種的耐鹽性[11]。本研究通過對不同濃度NaCl脅迫下國內外22份苜蓿種質的種子萌發狀況進行研究，旨在對其萌發期耐鹽性進行鑒定，并探討苜蓿種質耐鹽性鑒定的適宜鹽濃度，篩選出耐鹽型種質，為耐鹽苜蓿新品種選育和人工草地生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的22份苜蓿種質材料來自中種草業公司和北京克勞沃草業中心，具體信息見表1。

1.2 試驗設計

選用NaCl溶液作為培養液，設定溶液濃度為0(CK)、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%，每處理重復3次，每個重復選取大小均勻、籽粒飽滿的種子50粒，經0.1%的HgCl2消毒8 min后用蒸餾水沖洗5次，均勻置于鋪有雙層濾紙的9 cm培養皿中。培養皿置于RXZ-1000B型人工氣候箱，培養條件為晝/夜溫度為25 ℃/20 ℃，光照/黑暗時間為12 h/12 h，光照強度為5 000 lx。每天定時稱量，根據水分蒸發量補水以維持鹽濃度。連續3 d未有種子發芽結束發芽試驗，計算發芽率、發芽勢和發芽指數，結束時將幼苗放入烘箱，60 ℃烘干至恒質量后測量胚根、胚芽的干質量。

表1 二十二份苜蓿種質信息

1.3 相關指標及其計算方法

發芽率(germination rate，GR)=發芽結束時正常發芽種子數/供試種子數×100%；

發芽勢(germination energy，GE)=第5天正常發芽的種子數/供試種子數×100%；

發芽指數(germination index，GI)=∑Gt/Dt(Gt為第t日的發芽數，Dt為對應的發芽天數)；

某一指標相對值=鹽脅迫下的測定值/對照的測定值。

1.4 數據統計分析

用Excel 2007對數據進行統計和初步分析，利用SPSS 21.0對各鹽濃度下供試材料的相對發芽率、相對發芽勢、發芽指數、胚根干質量和胚芽干質量進行方差分析。對各測試指標相對值和鹽濃度進行一元二次曲線回歸分析(回歸方程RH=a+bS+cS2，系數a、b、c因材料而異)。根據方程計算各測試指標值下降到對照的50%時各供試材料的半致死鹽濃度(S50)，利用S50進行聚類分析，探討22份苜蓿種質材料的耐鹽級別。利用模糊數學中的隸屬函數法對各指標相對值進行換算，其公式為U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，i=1， 2， 3，…，n。式中：Xi表示第i個測定指標；Xmin表示第i個測定指標的最小值；Xmax表示第i個測定指標的最大值。得出每個鹽濃度下每份材料各指標的隸屬函數值，再求出每一指標在不同鹽濃度下隸屬函數值的平均值，利用得出的隸屬函數值均值進行聚類分析[12]。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對苜蓿種子相對發芽率和相對發芽勢的影響

隨著鹽濃度的增加，22份苜蓿種質的相對發芽率和相對發芽勢均顯著降低(P<0.05)，鹽脅迫后期相對發芽率、相對發芽勢較對照依次降低28.25%～94.3%、52.43%～93.61%，且隨著脅迫程度加強，其降低幅度就越大，但各種質相對發芽率和相對發芽勢對鹽脅迫的響應并不完全一致(表2)。

就相對發芽率而言，與對照相比，MX001、MX003、MX004等14份材料在0.4%鹽脅迫時就出現顯著降低(P<0.05)，其中MX003、MX017、MX018的降幅達到50%以上，對鹽脅迫比較敏感；在0.8%鹽脅迫時，MX002、MX005、MX006等7份材料的相對發芽率出現顯著降低(P<0.05)；而MX021在1.2%鹽脅迫時其相對發芽率才出現顯著降低(P<0.05)；當鹽濃度增至1.6%時，MX006、MX009、MX011仍保持10%以上的相對發芽率，表現出較強的耐鹽性(表2)。

就相對發芽勢而言，與對照相比，0.4%鹽脅迫下，MX003、MX007、MX008等14份材料就出現顯著降低(P<0.05)，其中MX007、MX009、MX017的相對發芽勢已降低至15%以下；當鹽濃度增至0.8%時，除MX001、MX004、MX006、MX014仍未出現顯著降低外，其余18份材料均顯著降低(P<0.05)；當鹽濃度為1.6%時，僅MX014的相對發芽勢仍保持在20%以上，顯示出較強的耐鹽性，MX002、MX004、MX006等12份材料中僅有少量種子萌發(表2)。

2.2 鹽脅迫對苜蓿胚根干質量和胚芽干質量的影響

隨著鹽濃度的增加，NaCl脅迫對大部分苜蓿種質胚根、胚芽的干物質積累表現出抑制作用(表3)。

就胚根干質量而言，隨著鹽濃度的增加，僅MX004較對照無顯著變化(P>0.05)。其余21份材料，與對照相比，0.4%鹽脅迫下MX003、MX011、MX017、MX018表現出顯著降低(P<0.05)，而MX009和MX010顯著升高(P<0.05)，說明0.4%鹽脅迫可促進其干物質積累；鹽濃度為0.8%～1.2%時，苜蓿種質胚根干質量均出現不同程度降低，但仍有9份材料在鹽濃度為1.2%時較對照未出現顯著變化，表現出對鹽脅迫較強的適應能力；當鹽濃度為1.6%時，所有材料胚根干質量較對照均顯著降低(P<0.05)。

就胚芽干質量而言，隨著鹽濃度的增加，MX010、MX021較對照無顯著變化。其余20份材料，與對照相比，當鹽濃度為0.4%時，MX002、MX004、MX005等12份材料胚芽干質量無顯著差異(P<0.05)，表明其對低濃度NaCl脅迫有一定的適應性；MX014的胚芽干質量在鹽濃度上升至1.6%時才顯著低于對照(P<0.05)，表明其胚芽干質量受鹽脅迫的影響僅次于MX010和MX021；其余材料胚芽干質量隨著鹽濃度的上升均不同程度顯著降低(P<0.05)。

表2 鹽脅迫對苜蓿種子相對發芽率和相對發芽勢的影響

同一指標同行數據后無相同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，下同。

Data marked without the same lowercase letter of the same index in each line indicated significant differences atP<0.05. The same as below.

表3 鹽脅迫對苜蓿胚根干質量和胚芽干質量的影響

2.3 鹽脅迫對苜蓿種子發芽指數的影響

由表4可知，隨著鹽濃度的增加，22份苜蓿種質發芽指數的平均值較對照均顯著降低(P<0.05)，降低幅度為56.00%～95.55%。與對照相比，當鹽濃度為0.4%時，僅MX002、MX014未出現顯著變化，其余20份材料顯著降低(P<0.05)；鹽濃度增加至0.8%時，所有材料的發芽指數較對照均顯著降低(P<0.05)，表明鹽脅迫下所有材料的種子活力均受到抑制；鹽濃度為1.6%時，所有材料的發芽指數較對照降低87.97%～99.47%(P<0.05)。

2.4 苜蓿種質半致死濃度分析

由表5可知，22份苜蓿種質的耐鹽半致死濃度(S50)均值為0.85%，變異系數為26.38%。在各指標中，22份材料發芽率、發芽勢、發芽指數的S50均值相對較低，分別為0.80%、0.71%和0.60%，顯示出對鹽脅迫較為敏感，其變異系數分別為31.74%、50.02%和34.36%，胚根干質量和胚芽干質量的S50均值相對較高，分別為1.11%和1.03%，變異系數分別為29.25%和33.76%。總的來看，不同耐鹽指標的S50間存在較大差異，在選擇指標時應區別對待。

以發芽率、發芽勢、發芽指數、胚根干質量和胚芽干質量的半致死濃度S50為依據進行聚類分析，22份材料被聚為3類。結合其S50均值來看，MX002、MX006和MX009等11份材料S50的均值為1.02%，為耐鹽型種質；MX004、MX005、MX007、MX008、MX011、MX019的S50均值為0.77%，為中度耐鹽型種質；其余5份材料S50的均值為0.57%，為敏鹽型種質。

2.5 苜蓿種質耐鹽性綜合評價

植物的耐鹽性是植物對鹽脅迫的適應，是多種代謝的綜合體現。在萌發期對植物耐鹽性進行評價時，不但要考慮鹽脅迫下的種子萌發能力，而且要考慮其發芽后幼苗的正常生長，僅使用單一評價指標不能客觀真實地反映植物的耐鹽型。對表2～表4進行綜合分析可知，不同評價指標下各品種的耐鹽型強弱具有較大差異。因此，本研究以不同濃度鹽脅迫下相對發芽率、相對發芽勢、相對發芽指數、相對胚根干質量和相對胚芽干質量的隸屬函數值的平均值為依據(表6)，對22份苜蓿種質的耐鹽性進行聚類分析，在歐式距離為15處將22份苜蓿種質分為3組(圖1)。由圖1和表7可知，Ⅰ組中包括MX001、MX003、MX007、MX016和MX017，其半致死濃度S50均值和隸屬函數值均值均小于Ⅱ和Ⅲ組，為敏鹽型種質；Ⅱ組中包括MX005、MX008、MX009、MX010、MX011、MX012、MX015和MX021，其半致死濃度S50均值和隸屬函數值均和隸屬函數值均值均大于Ⅰ和Ⅱ組，為耐鹽型種質。

表4 鹽脅迫對苜蓿種子發芽指數的影響

表5 苜蓿種子的耐鹽半致死濃度

S、M和T分別表示耐鹽類型為敏鹽型、中度耐鹽型和耐鹽型。下同。

S， M and T were represented salt sensitive type， moderate salt tolerance type and salt tolerance type， respectively. The same as below.

表6 二十二份苜蓿種質材料各指標隸屬函數值

圖1 NaCl脅迫下22份苜蓿耐鹽性聚類分析Fig.1 Cluster analysis of salt tolerance among 22 alfalfa germplasms under salt stress

值均大于Ⅰ組，為中度耐鹽型種質；Ⅲ組中包括MX002、MX004、MX006、MX013、MX014、MX018、MX019、MX020和MX022，其半致死濃度S50均值

2.6 苜蓿種質耐鹽性鑒定適宜濃度的確定

由表8可知，隨著鹽濃度增加，22份苜蓿種質各測試指標的變異系數整體呈增大趨勢，其耐鹽性的差異也得以顯現。鹽濃度為0.4%～0.8%時，供試材料相對發芽率、相對發芽勢、相對發芽指數、相對胚根干質量和相對胚芽干質量較對照均出現顯著降低(P<0.05)(表2、表3、表4)，其中，相對發芽率、相對發芽勢和相對發芽指數受鹽脅迫影響較為嚴重；在1.2%～1.6%鹽脅迫下，22份苜蓿種質所有指標均降低，且80%以上測試指標顯著降低，變異系數大，受鹽害嚴重，但鹽濃度為1.6%時各測試指標值均較小，不能較好地區分各種質耐鹽性的強弱。因此，鹽濃度為1.2%可作為苜蓿種質耐鹽鑒定的適宜濃度。以鹽濃度為1.2%時相對發芽率、相對發芽勢、相對發芽指數、相對胚根干質量和相對胚芽干質量的隸屬函數值平均值為依據(表6)，對22份苜蓿種質的耐鹽性進行聚類分析，在歐式距離為15處將22份材料分為3組(圖2)。由圖2和表7可知，Ⅰ組包括MX001、MX003、MX005、MX007、MX008、MX011、MX016和MX017，其半致死濃度S50和隸屬函數值均值均小于Ⅱ和Ⅲ組，為敏鹽型種質；Ⅱ組包括MX002、MX004、MX009、MX010、MX012、MX013、MX015、MX019和MX021，其半致死濃度S50和隸屬函數值均值大于Ⅱ組，為中度耐鹽型種質；Ⅲ組包括MX006、MX014、MX018、MX020和MX022，其半致死濃度S50和隸屬函數值均值均大于Ⅰ和Ⅱ組，為耐鹽型種質。

表7 聚類后各組綜合指標均值及種質耐鹽類型劃分

表8 鹽脅迫下各指標總體變異系數

圖2 1.2% NaCl脅迫下22份苜蓿耐鹽性聚類分析Fig.2 Cluster analysis of salt tolerance among 22 alfalfa germplasms under 1.2% NaCl stress

3 結論與討論

種子在鹽脅迫下首先面臨的是鹽濃度導致的滲透脅迫，從而影響種子對水分的吸收。水分在種子萌發過程中是非常關鍵的因素之一[13]，種子經吸漲作用從外界吸取足夠的水分后，胚細胞中儲存的蛋白質和RNA活化以合成種子萌發過程中所需的各種酶和蛋白，進而完成其整個發芽過程，形成新的植株[14]。鹽脅迫下離子的毒害作用也會抑制種子萌發過程中酶的合成和活性，進而影響種子正常萌發和苗的正常生長[15]，因此，鹽脅迫下種子萌發受滲透作用和離子毒害雙重抑制。本研究中苜蓿的相對發芽率、相對發芽勢、胚根干質量、胚芽干質量和發芽指數隨著鹽濃度的增加均受到抑制，且鹽濃度越大抑制作用越強，這與前人研究結果一致[16-18]，說明鹽脅迫不僅影響種子萌發，而且影響種子苗干物質積累。

植物受脅迫后表現出耐鹽性是一個復雜的過程，其耐鹽能力的大小受多種代謝共同影響[19]，不同物種對鹽脅迫的適應能力和機制存在差異，同一物種或品種的耐鹽性也會因生長時期不同或所選評價指標不同而異[20-21]，因此不能僅用單一的指標來評價植物的耐鹽性[22]。對22份苜蓿種質進行耐鹽性綜合評價的結果表明，不同NaCl濃度下苜蓿種子萌發和苗生長狀況不一致，因此，以不同NaCl濃度下相對發芽率、相對發芽勢、相對胚根干質量、相對胚芽干質量、相對發芽指數的隸屬函數值均值為依據，通過聚類分析將22份苜蓿種質分為耐鹽型種質(MX002、MX004、MX006、MX013、MX014、MX018、MX019、MX020和MX022)、中度耐鹽型種質(MX005、MX008、MX009、MX010、MX011、MX012、MX015和MX021)、敏鹽型種質(MX001、MX003、MX007、MX016和MX017)。對22個苜蓿種質的半致死濃度S50進行計算并以此為依據進行聚類分析。結果表明，22份苜蓿種質的S50均值為0.85%，變異系數為26.38%，而且該聚類分析結果與22份苜蓿種質耐鹽性綜合評價結果較為一致。

進行植物種質耐鹽性鑒定濃度選擇時，不僅要保證供試材料的測試指標較對照出現顯著受害癥狀，且測定值不能太低，避免真實耐鹽情況為試驗誤差所掩蓋，而且要保證NaCl脅迫下同一指標各品種間變異系數較大，以便于區分各材料間的耐鹽型差異[23]。依據此原則，確定1.2% NaCl為苜蓿種質耐鹽鑒定適宜濃度，該濃度下苜蓿種質的相對發芽率、相對發芽勢、相對發芽指數、相對胚根干質量和相對胚芽干質量與對照相比均顯著降低(P<0.05)，且材料間各指標變異系數較大(33.18%～53.54%)，這與前人在耐鹽性鑒定中所選適宜鹽濃度一致[23-25]。以1.2% NaCl脅迫下各指標的隸屬函數值均值為依據的評價結果與以4個NaCl脅迫下各指標的隸屬函數值均值為依據進行綜合評價的結果也基本一致，材料MX006、MX014、MX020和MX022在3次聚類綜合分析中都表現為耐鹽型種質，材料MX001、MX003、MX016和MX017在3次聚類綜合分析中都表現為敏鹽型種質。

植物耐鹽性是一個由多因素相互作用形成的生理生態響應過程，同一種植物的耐鹽性也會因生育時期不同而存在一定差異。本研究僅在萌發期對22份苜蓿種質的耐鹽性進行了綜合評價，并篩選出了耐鹽型種質牧王、愛菲尼特、德國德貝和金皇后，敏鹽型種質敖漢、A/S綜合、費納爾和潤布11。但為了保證篩選出的材料準確可靠，后期應根據初步篩選結果對篩選出的種質繼續進行苗期耐鹽性鑒定和鹽土萌發驗證，以便更好地指導生產實踐，為苜蓿耐鹽新品種選育奠定基礎。