杜仲內(nèi)生細(xì)菌拮抗小麥赤霉病菌研究

陳小潔，王 其，張欣悅，丁 婷

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，安徽 合肥 230036)

由鐮孢屬禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)侵染引起的赤霉病主要危害小麥的穗部，會引起小麥產(chǎn)量下降，危害人畜健康[1-4]，使小麥產(chǎn)生抗藥性[5-9]，是對小麥生產(chǎn)威脅最大的真菌病害之一。隨著免耕、秸稈還田種植技術(shù)的推廣，化肥使用量的增加和小麥品種抗性的喪失，該病的發(fā)生逐年加重。為此，生物防治在小麥赤霉病的綜合治理中顯得更為重要。近年來，利用植物內(nèi)生菌防治病害的研究得到較多關(guān)注[10-11]。在眾多的生防菌應(yīng)用中，生防細(xì)菌因其種類多、生活周期短、代謝活動快且產(chǎn)物多、繁殖能力高、對病原菌的作用方式多樣[12]、易人工培養(yǎng)等特點，在生物防治中起著重要作用[13]。

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國名貴的中藥材之一。本試驗擬從杜仲中分離內(nèi)生細(xì)菌，以小麥赤霉病菌為指示菌，對杜仲內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行拮抗細(xì)菌的篩選和鑒定。通過活體盆栽試驗研究拮抗細(xì)菌對小麥赤霉病防治情況，探討拮抗細(xì)菌對小麥赤霉病菌分生孢子萌發(fā)過程的影響，初步探索了拮抗細(xì)菌對小麥赤霉病菌的抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 材料

杜仲根、葉、莖的健康組織，均于2017年9月10日采自于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)種植的健康杜仲。小麥品種為安農(nóng)1314，小麥赤霉病菌(F.graminearum)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病理教研室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及藥劑

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 L。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g。

羧甲基纖維素培養(yǎng)基(CMC)：CMC 15 g，yeast extract 1 g，NH4NO31 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1 L。

Landy培養(yǎng)基： L-glutamic acid 5 g·L-1，yeast extract 1 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，MnSO4·H2O 5 mg·L-1，L-phenylalanine 2 mg·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.16 mg·L-1，KH2PO41 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至7.0。

供試藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑WP(江蘇三山農(nóng)藥有限公司)；98%多菌靈原藥由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病理教研室提供。

練習(xí)的設(shè)計盡量避免題海戰(zhàn)術(shù)，做到輕負(fù)高效。為了達(dá)到這個目的，老師首先要跳入題海，精煉題型，突出重點，提高實效，將學(xué)生從繁重的課業(yè)中解放出來。

1.2 試驗方法

《東風(fēng)破》典故的使用的比例大大超過了對其他常見修辭格的運用，由下面列出的統(tǒng)計結(jié)果(見表2.2)可以看出典故的使用幾乎貫穿全歌詞。

杜仲內(nèi)生細(xì)菌分離方法參照Ding等[14]的方法，對已純化的菌株編號，轉(zhuǎn)至NA斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，然后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用16S rDNA進(jìn)行菌種鑒定，采用試劑盒法提取杜仲內(nèi)生拮抗細(xì)菌DZSG23基因組。PCR擴(kuò)增程序和擴(kuò)增體系參照Chelo等[18]的方法。將16S rDNA PCR產(chǎn)物純化后送生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，所得序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，并通過MEGA 5.1軟件對菌株進(jìn)行進(jìn)化分析，確定其分類地位。

采用平板對峙的方法[15]，將小麥赤霉病菌接種于PDA培養(yǎng)基上，在接有病原菌平板的等距離處劃線接種杜仲內(nèi)生細(xì)菌，每個處理3個重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)。待對照組長滿培養(yǎng)皿時，測量抑菌帶距離，按照如下公式計算抑制率：

菌落生長距離=測量菌落平均直徑-5 mm

抑制率(%)=

其中,r為無風(fēng)險利率;q為股息收益率;σ是波動率;W(t)是一個維納過程,N(t)是與W(t)獨立且強(qiáng)度為λ的Poisson過程;J(t)是t時刻標(biāo)的資產(chǎn)價格隨機(jī)跳的相對高度,滿足由文獻(xiàn)[14]可知Merton跳-擴(kuò)散模型的特征函數(shù)為

1.2.3 生防細(xì)菌活體盆栽試驗

生防細(xì)菌菌懸液制備：將抑菌效果較好的拮抗菌接種于NA液體培養(yǎng)基里，37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h后備用(菌體濃度為1×106CFU·mL-1)。

小麥赤霉病菌分生孢子懸浮液制備：將小麥赤霉病菌接種至CMC培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)(25 ℃、全光照或光照12 h·d-1、180 rpm·min-1培養(yǎng)4 d)，獲得小麥赤霉病菌分生孢子，調(diào)節(jié)孢懸液濃度至1×105CFU·mL-1。

將小麥種子(安農(nóng)1314)進(jìn)行催芽處理，24 h后選取露白狀況一致的種子分別浸于滅菌NA液體培養(yǎng)基或拮抗菌發(fā)酵培養(yǎng)物中5 h[16]，然后分別播種在花盆中。每盆播種15粒，待小麥長至揚(yáng)花期進(jìn)行如下處理。

(1)空白對照(CK)：在長勢相當(dāng)?shù)男←溗肷蠂娛o菌的NA液體培養(yǎng)基，套袋保濕48 h后正常水肥管理。

(2)小麥赤霉病菌處理(B)：在長勢相當(dāng)?shù)男←溗肷蠁位ǖ巫⒔臃N小麥赤霉病菌孢懸液，套袋保濕48 h后正常水肥管理。

1.2.5 拮抗菌株DZSG23對小麥赤霉病菌的拮抗作用

(4)多菌靈+小麥赤霉病菌處理(Y)：將配置好的50%多菌靈可濕性粉劑500倍溶液直接噴灑于小麥穗上，套袋保濕48 h后單花滴注接種小麥赤霉病菌孢懸液，繼續(xù)套袋保濕48 h后正常水肥管理。

接種小麥赤霉病菌后的第4、7、10、14、17天對不同處理組進(jìn)行病害調(diào)查，計算病情指數(shù)和防效。結(jié)果見表2。隨著處理時間的延長，B、SB和Y處理組赤霉病的病情指數(shù)均呈緩慢增長趨勢，接種病原菌第10天，B處理組病情指數(shù)達(dá)到68.62，而同一生長期的DZSG23處理組小麥發(fā)病較輕，病情指數(shù)僅為40.56，與Y處理組差異顯著，但顯著低于DZSJ16處理組和DZSG09處理組；截至第17天，B處理組病情指數(shù)達(dá)到86.49，而同一生長期的DZSG23、DZSJ16和DZSG09處理組和Y處理組小麥病情指數(shù)分別為62.73、78.48、71.12和53.27。上述結(jié)果說明，在小麥中引入DZSG23菌株可顯著提高小麥植株對赤霉病的抗性，降低赤霉病的發(fā)病率。

滅菌載玻片中央放置15 mm × 10 mm的無菌PDA薄膜一塊，分別接種DZSG23和小麥赤霉病菌于PDA薄膜兩平行邊的中點，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，逐天鏡檢兩菌的相互作用并顯微拍照。

1.2.4 DZSG23的種群鑒定

1.2.2 拮抗細(xì)菌的篩選

if(oldState!=null&&value=="initiated")OnStateInitiatedChange(myEventArgs);

(3)拮抗菌+小麥赤霉病菌處理組(SB)：將拮抗菌菌懸液直接噴灑于小麥穗上，套袋保濕48 h后單花滴注接種小麥赤霉病菌孢懸液，套袋保濕48 h后正常水肥管理。

1.2.6 拮抗菌株DZSG23對小麥赤霉病菌分生孢子萌發(fā)的影響

國家之強(qiáng)弱，視教育發(fā)達(dá)與否為標(biāo)準(zhǔn)。東西各國規(guī)定義務(wù)教育，凡學(xué)齡兒童已達(dá)就學(xué)之期，非有不得已事故不得廢學(xué)，否則罪其父母，此教育之所以溥及而國乃以強(qiáng)盛。方今民國初定，百端待理，顧尤以普及教育為根本之要圖。而謀普及教育，須從調(diào)查學(xué)齡兒童入手，某地應(yīng)添設(shè)學(xué)校幾所，某地應(yīng)需經(jīng)費若干，種種設(shè)施，皆恃是以為準(zhǔn)則。而以學(xué)齡兒童之人數(shù)比較就學(xué)差數(shù)之多少，尤足覘各地文化之遲速。[13]

問：我奶奶85歲，有痔瘡而且腹瀉嚴(yán)重，幾乎吃點東西就要上廁所，肚里存不住東西，這樣對老人身心健康不利，家人很擔(dān)心，去醫(yī)院也查不出什么問題。請問楊老師如何治療，或是吃點什么補(bǔ)品？

DZSG23菌懸液和次級代謝產(chǎn)物制備：拮抗菌DZSG23接種于NA液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，離心后分別取上清發(fā)酵液和菌體。發(fā)酵液凍干為次級代謝產(chǎn)物，菌體無菌水重懸(菌懸液濃度為1×106CFU·mL-1)，-20 ℃冰箱備用。

CMC培養(yǎng)基培養(yǎng)小麥赤霉病菌的分生孢子，病原菌孢懸液濃度調(diào)節(jié)至1×105CFU·mL-1。試驗設(shè)置4個處理：空白對照、98%多菌靈、DZSG23菌懸液、DZSG23次級代謝產(chǎn)物。其中，98%多菌靈和DZSG23次級代謝產(chǎn)物分別與0.5 mL 1×105CFU·mL-1的赤霉病菌孢懸液和適量PDA液體培養(yǎng)基混合，終體積為5 mL。使98%多菌靈終濃度達(dá)到5、10 μg·mL-1，DZSG23次級代謝產(chǎn)物終濃度達(dá)到5、10 mg·mL-1，赤霉病菌孢懸液濃度達(dá)到1×106CFU·mL-1。置于28 ℃培養(yǎng)箱中，分別于培養(yǎng)6、12、24、30和36 h觀察不同處理組的小麥赤霉病菌分生孢子萌發(fā)、分生孢子芽管形態(tài)和菌絲體的形成等，測定小麥赤霉病菌分生孢子的萌發(fā)率和畸形率。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離篩選

從杜仲的根、莖、葉中共分離得到104株內(nèi)生細(xì)菌，如表1所示。采用16S rDNA初步鑒定出104株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)6個屬，菌株的GenBank登錄號如表1所示。其中，芽孢桿菌屬(Bacillus)內(nèi)生細(xì)菌共39株，占分離內(nèi)生細(xì)菌總數(shù)的37.50%，在杜仲的根、莖、葉中廣泛分布。

采用平板對峙法測定104株杜仲內(nèi)生細(xì)菌對小麥赤霉病菌的抑菌活性，結(jié)果如表1所示。抑菌率超過60%的分別為DZSG09、DZSJ16、DZSG23，其中，DZSG23對小麥赤霉病菌的抑制率達(dá)到了69.04%。后續(xù)試驗選擇上述3株菌株開展對小麥赤霉病防治的盆栽試驗。

表1 杜仲內(nèi)生細(xì)菌對小麥赤霉病菌的抑制作用

續(xù)表1

表中所列數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值。

Data listed in the table were the average of 3 replicates.

2.2 拮抗細(xì)菌對小麥赤霉病菌的盆栽防效試驗

每種處理設(shè)3盆作為重復(fù)，分別在接種小麥赤霉病菌后的第4、7、10、14、17天進(jìn)行病情調(diào)查。小麥赤霉病的病情嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)參考李洪連等[17]的方法，公式如下：

1.2.1 杜仲內(nèi)生細(xì)菌的分離

2.2 兩組右側(cè)基底節(jié)區(qū)各代謝物比值的比較 結(jié)果(表1，圖1)表明：HIE組患兒中右側(cè)基底節(jié)區(qū)NAA/Cho、NAA/Cr明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HIE組患兒中右側(cè)基底節(jié)區(qū)Lac/Cr高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

隱喻是大學(xué)生心理活動的重要表現(xiàn)形式。探索大學(xué)生隱喻可以揭示大學(xué)生內(nèi)心的心理取向。此研究主要是了解大學(xué)生的隱喻意識以及使用隱喻的價值取向。主要研究以下問題：

2.3 杜仲內(nèi)生細(xì)菌的種群鑒定

以DZSG23基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rDNA序列并測序。NCBI序列比對發(fā)現(xiàn)，DZSG23的16S rDNA序列與枯草芽孢桿菌B.subtilis(KC146707.1)的核苷酸序列相似性最高；采用DNAMAN軟件，構(gòu)建菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)DZSG23與枯草芽孢桿菌B.subtilis聚成一個分支，說明菌株DZSG23與芽孢桿菌屬各菌株親緣關(guān)系最近，而與腸桿菌屬各菌株的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)(圖1)。因此，初步鑒定菌株DZSG23為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)株系。

究竟什么原因造成“放炮”呢？能不能降服甚至消滅“炮老虎”，打破外國專家“放炮難免”的斷言呢？高壓聚乙烯車間干部員工絞盡了腦汁，董松江也在暗中較勁。

2.4 DZSG23對小麥赤霉病菌菌絲生長的抑制

在接種小麥赤霉病菌4 d后，對照平板上小麥赤霉病菌菌絲體生長旺盛且長滿整個平板(圖2-a)，而在接種芽孢桿菌DZSG23的平板上小麥赤霉病菌受到抑制，形成明顯的抑菌帶(圖2-b)。對抑菌帶內(nèi)的小麥赤霉病菌菌絲進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，小麥赤霉病菌菌絲明顯膨大、扭曲變形(圖2-d箭頭所示)，而對照的菌絲形態(tài)正常，無異常變化(圖2-c)。

（4）Cl-在 H-103樹脂上的吸附熵變 ΔS＞0，表明在Cl-的吸附過程中同時存在著溶劑的解吸，吸附熵變ΔS變化很小，ΔS變化范圍為0.004～0.1 k J·mol-1。

表2 接種赤霉病菌不同時間小麥赤霉病的病情指數(shù)

“—”表示無此項。同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示0.05水平上差異顯著。

“—” means no defense. Data without the same letters in a column indicated significant differences according to Duncan’s multiple range test (α=0.05)

圖1 DZSG23菌株16S rDNA序列的進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree of the strain DZSG23 based on 16S rDNA

2.5 拮抗菌株DZSG23對小麥赤霉病菌分生孢子的影響

2.5.1 分生孢子萌發(fā)

不同時間段，以空白對照為陰性對照，分別檢測98%多菌靈、DZSG23菌懸液、DZSG23次級代謝產(chǎn)物處理組中小麥赤霉病菌分生孢子的萌發(fā)率，結(jié)果如圖3所示。不同處理組小麥赤霉病菌的分生孢子萌發(fā)速率存在較明顯差異，98%多菌靈處理組和DZSG23菌懸液一定程度上均能延緩分生孢子萌發(fā)時間。截至第36小時，5、10 μg·mL-1的98%多菌靈處理后的小麥赤霉病菌分生孢子萌發(fā)率分別為98.56%和93.22%，DZSG23菌懸液(1×106CFU·mL-1)處理的小麥赤霉病菌分生孢子萌發(fā)率為98.04%，與多菌靈處理組無明顯差異；而DZSG23次級代謝產(chǎn)物處理組對小麥赤霉病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用較小，病原菌分生孢子在12 h后幾乎全部萌發(fā)。說明，DZSG23菌懸液可減緩小麥赤霉病菌分生孢子的萌發(fā)速率，但36 h后不能抑制孢子的萌發(fā)，而其次級代謝產(chǎn)物對小麥赤霉病菌分生孢子的萌發(fā)幾乎無影響。

“醫(yī)院從2015年開始推行‘崗位目標(biāo)責(zé)任書’，就是為了規(guī)避部門制定目標(biāo)時的種種問題。從那時，我們就提出，由醫(yī)院整體核定目標(biāo)。”韓建峰表示，醫(yī)院結(jié)合西安交通大學(xué)辦學(xué)定位、醫(yī)院五年規(guī)劃等制定目標(biāo)，把目標(biāo)進(jìn)行分解，細(xì)化到每一年，使醫(yī)院發(fā)展有比較具體的目標(biāo)。每一年的落實中，每個職能科室結(jié)合實際情況制定目標(biāo)。

a，小麥赤霉病菌培養(yǎng)4 d；b，菌株DZSG23與小麥赤霉病菌對峙培養(yǎng)4 d；c，正常的小麥赤霉病菌菌絲形態(tài)；d，變形的小麥赤霉病菌菌絲形態(tài)。a， F. graminearum cultured for 4 days; b， Confront antibiotic culture experiment of strain DZSG23 and F. graminearum for 4 days; c， Shape of normal mycelia of F. graminearum; d， Shape of deformed mycelia of F. graminearum.圖2 菌株DZSG23與小麥赤霉病菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果Fig.2 Confront antibiotic culture experiment of strain DZSG23 and F. graminearum

a，多菌靈處理；b，菌懸液處理；c，次級代謝產(chǎn)物處理。a， Carbendazol; b， DZSG23 suspension; c， Secondary metabolites of DZSG23.圖3 不同處理對小麥赤霉病菌分生孢子萌發(fā)速率的影響Fig.3 Effects of different treatments on the conidiospore germination rate of F. graminearum

2.5.2 分生孢子畸形率

以空白對照為陰性對照，分別檢測98%多菌靈、DZSG23菌懸液、DZSG23次級代謝產(chǎn)物處理組中小麥赤霉病菌分生孢子的畸形率，結(jié)果如圖4所示。隨著處理時間的延長，不同濃度多菌靈的添加均可以快速增加小麥赤霉病菌分生孢子的畸形率，截至第36小時，5、10 μg·mL-1多菌靈處理組赤霉病菌分生孢子致畸率分別為97.63%和96.29%；DZSG23菌懸液(1×106CFU·mL-1)也可迅速提高小麥赤霉病菌分生孢子的畸形率，處理6 h，畸形率達(dá)14.50%，處理36 h，畸形率升高至57.70%；DZSG23次級代謝產(chǎn)物的致畸作用相對較低，截至第36小時，5、10 mg·mL-1次級代謝產(chǎn)物處理組對赤霉病菌分生孢子致畸率僅分別為30.46%和36.67%。處理6 h不同處理組中的赤霉病菌分生孢子形態(tài)如圖5所示，空白對照組的赤霉病菌分生孢子大多從頂端萌發(fā)，萌發(fā)形成的菌絲光滑而均勻；與此同時，多菌靈、DZSG23菌懸液及其次級代謝產(chǎn)物處理的病原菌分生孢子及其芽管均出現(xiàn)膨大、扭曲和畸形等現(xiàn)象。

針對實際訓(xùn)練中常常存在過擬合的問題,本文采用 Dropout方法來對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行正則化[14]。由于大棚中環(huán)境變量數(shù)據(jù)量大且變化緩慢,所以在訓(xùn)練過程中以0.1的概率隨機(jī)丟棄網(wǎng)絡(luò)中的一些神經(jīng)元以及相互之間的權(quán)重連接,提升模型的泛化能力,不易對訓(xùn)練數(shù)據(jù)過擬合。

a，多菌靈處理；b，菌懸液處理；c，次級代謝產(chǎn)物處理。a， Carbendazol; b， DZSG23 suspension; c， Secondary metabolites of DZSG23.圖4 不同處理對小麥赤霉病菌分生孢子畸形率的影響Fig.4 Effects of different treatments on conidiospore deformity rate of F. graminearum

a，空白對照；b，多菌靈(4 μg·mL-1)處理；c，菌懸液(1×106 CFU·mL-1)處理；d，次級代謝產(chǎn)物(10 mg·mL-1)處理。a， Blank control; b， Carbendazol(4 μg·mL-1); c， DZSG23 suspension(1×106 CFU·mL-1); d， Secondary metabolites of DZSG23(10 mg·mL-1). 圖5 不同處理6 h后的分生孢子及其芽管畸形Fig.5 Abnormality of conidia and their germ tubes under different treatments for 6 h

3 討論

本研究以小麥赤霉病菌為靶標(biāo)，篩選獲得一株具有較高抑菌活性的杜仲內(nèi)生細(xì)菌DZSG23，將其引入小麥，可明顯提高小麥植株對赤霉病的抗性，減少赤霉病對小麥的危害。進(jìn)一步的研究表明，芽孢桿菌DZSG23可引起小麥赤霉病菌菌絲的腫脹、膨大，降低孢子萌發(fā)速率，并使分生孢子及其萌發(fā)出的芽管畸形。該試驗結(jié)果為抗小麥赤霉病拮抗菌的篩選及生防機(jī)理研究提供了理論基礎(chǔ)。

植物內(nèi)生菌作為一種新型的微生物資源，近年來在植物病害生物防治中發(fā)揮著重要的作用[19-21]。杜仲作為中國傳統(tǒng)的藥用植物，不容易被植物病蟲害感染，具有抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等藥理活性[22]，因此，從杜仲中分離篩選拮抗內(nèi)生菌在實際生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用前景。本研究以安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園中生長多年的健康杜仲植物為材料，進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離純化，最終獲得內(nèi)生細(xì)菌104株，分屬于6個屬：芽孢桿菌屬(Bacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)，這與已有的從杜仲健康組織中分離到的內(nèi)生細(xì)菌種群相比[23]，僅有短芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬等少數(shù)種群一致，而分離出的其他細(xì)菌的數(shù)量和種類均有差異。究其原因，一方面可能是由于內(nèi)生菌依附的寄主植物受生長環(huán)境、氣候等外界因素的影響，其生長狀況和生理特性均存在差異；另一方面，本試驗以NA培養(yǎng)基作為內(nèi)生細(xì)菌分離純化的培養(yǎng)基，但由于不同菌株要求的營養(yǎng)條件不同，因此，可能導(dǎo)致一些生長條件比較苛刻的專性內(nèi)生細(xì)菌難以生長，反映在試驗結(jié)果上，即分離出的杜仲內(nèi)生細(xì)菌在種群數(shù)量上與相關(guān)文獻(xiàn)報道均存在一定的差異。

該研究中獲得的對小麥赤霉病菌具有較好拮抗活性的DZSG23，經(jīng)16S rDNA鑒定為芽孢桿菌屬微生物。芽孢桿菌作為重要的生物防治資源，廣泛存在于土壤等自然環(huán)境中，亦是常見的植物內(nèi)生菌，在玉米、水稻等多種植物中均有其分布[24-25]，其可通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、競爭作用、誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生抗病性等多種機(jī)理抑制植物病原菌生長，在防治植物病害中發(fā)揮重要作用。如楊瑞先等[26]從牡丹根部組織中分離出的2株解淀粉芽孢桿菌Md31和Md33均具有合成脂肽類物質(zhì)的能力，且2個菌株的脂肽類粗提物也具有較強(qiáng)的體外抑菌活性。姬婧媛等[27]發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌菌株E1R-j產(chǎn)生的抗菌脂肽類物質(zhì)可對小麥全蝕病菌菌絲有抑制作用，可使菌絲細(xì)胞畸形、細(xì)胞壁潰解、細(xì)胞質(zhì)外滲等。本研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌DZSG23不僅可引起小麥赤霉病菌菌絲的腫脹、膨大，還可降低孢子萌發(fā)速率，引起分生孢子細(xì)胞及其芽管產(chǎn)生畸形。引起上述現(xiàn)象的原因是否是芽孢桿菌屬微生物DZSG23產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)而導(dǎo)致的尚不明確，因此后續(xù)試驗中，將開展DZSG23相關(guān)脂肽類抑菌物質(zhì)的研究，在明確拮抗菌株DZSG23所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)種類的同時，明晰其脂肽類物質(zhì)的抑菌活性。此外，由DON毒素引起的麥粒中毒是我國和其他一些國家最主要的真菌性食物中毒之一，目前，DON毒素的分析檢測及毒性研究倍受重視[28-29]。該研究僅開展了DZSG23菌株對小麥赤霉病的盆栽防控評價及其對赤霉病菌菌絲和分生孢子的影響，而DZSG23菌株的引入能否抑制小麥赤霉病菌毒素的產(chǎn)生尚不清楚。因此，后續(xù)試驗中將利用高效液相色譜法對其開展深入研究，明確拮抗菌株對赤霉病菌毒素產(chǎn)生的影響機(jī)制。

迄今為止，小麥赤霉病仍以噴施化學(xué)殺菌劑為主，然而，長期大量的施用殺菌劑，不僅誘發(fā)產(chǎn)生抗藥禾谷鐮孢菌菌株[6]、農(nóng)藥殘留超標(biāo)[30]，還促進(jìn)毒素生物合成[31]，也造成環(huán)境污染。近年來，大量的研究工作圍繞小麥赤霉病拮抗生防菌的篩選和相關(guān)抑菌機(jī)制進(jìn)行展開，并獲得了較多的拮抗微生物。管章玲等[32]從多種植物體和土壤中分離出30株對禾谷鐮刀菌有明顯抑制作用的菌株，菌株NS-QCT的抑菌活性最強(qiáng)。王建偉[33]發(fā)現(xiàn)其篩選的菌株AF0907是通過分泌某種抗菌物質(zhì)來抑制小麥赤霉病菌的，初步鑒定該抗菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)。且部分微生物已經(jīng)獲得農(nóng)藥登記許可證[34]，但是多數(shù)拮抗微生物雖在實驗室條件下能表現(xiàn)出良好的抑菌活性，但在大田條件下，由于環(huán)境條件的改變，不能很好地適應(yīng)田間微環(huán)境，無法快速生長繁殖，從而難以發(fā)揮抑菌作用，導(dǎo)致生防效果不盡理想。因此，提高生防菌在田間地上部位和根際的定殖、快速繁殖能力，是拮抗微生物田間施用中需要考慮并解決的問題。后續(xù)研究中，該試驗計劃利用基因標(biāo)記或抗藥性標(biāo)記等技術(shù)，進(jìn)一步研究DZSG23在植株的定殖動態(tài)，提高其在小麥中的定殖效能。