實(shí)時定量PCR法快速檢測水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌

陳 琳，周青青，顧 青，*，酈 萍

(1.浙江工商大學(xué) 浙江省食品微生物技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018； 2.杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，浙江 杭州 310018)

副溶血性弧菌又稱腸炎弧菌，是一種廣泛分布在海洋和水產(chǎn)品中的嗜鹽性革蘭氏陰性菌，在腌肉、咸菜等高鹽制品中也可檢出[1]。若含有該菌的水產(chǎn)品未煮熟或處理不當(dāng)，食用后極容易引起食物中毒[2]。因此，快速高效地檢測水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌[3]，對于及時診斷和降低此類風(fēng)險至關(guān)重要。

目前，食品中副溶血性弧菌的檢測方法主要可分為2類：一類是微生物平板計數(shù)方法；另一類是常規(guī)的PCR檢測[4]。平板計數(shù)方法操作復(fù)雜，耗時；常規(guī)的PCR檢測方法需要從反應(yīng)體系中吸取產(chǎn)物做電泳，轉(zhuǎn)移過程中易污染，從而造成假陽性，而且耗費(fèi)時間[5]。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)是建立在PCR基礎(chǔ)之上的一種可對整個未知序列的基因組進(jìn)行多態(tài)性分析的分子技術(shù)，具有退火溫度低、核苷酸引物與模板的結(jié)合穩(wěn)定、擴(kuò)大引物配對的隨機(jī)性、檢出率高、簡單易操作、省時省力的特點(diǎn)[6]。實(shí)時定量PCR技術(shù)利用熒光信號實(shí)時監(jiān)測PCR進(jìn)程，直接進(jìn)行定量分析[7]，快速，準(zhǔn)確，高效。

浙江省地處我國東南沿海長江三角洲南翼，水產(chǎn)品資源豐富。近年來，由副溶血性弧菌引起的食物中毒是該省報告發(fā)病最多的食物中毒病種。相關(guān)報告顯示，浙江省細(xì)菌性食物中毒案例中， 43.06%為由副溶血性弧菌引起的食物中毒[8]。本文從20株副溶血性弧菌的基因中找出特異性高的序列，設(shè)計引物，建立一種基于熒光定量PCR快速檢測副溶血性弧菌的方法，并通過對部分市售水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌污染進(jìn)行檢測，測試該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

副溶血性弧菌：本實(shí)驗(yàn)室從浙江、福建、山東等地分離到175株副溶血性弧菌，根據(jù)GB 4789.7—2013驗(yàn)證為副溶血性弧菌，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。樣本來源覆蓋食物中毒病患和不同類別的水產(chǎn)品，如櫻花蝦、螠蟶、牡蠣、蛤蜊、花蛤、泥螺、盔螺、竹蟶、海螺、鯧魚、墨吉對蝦、明蝦、獨(dú)角對蝦、灰背蝦、小龍蝦、竹蟶，具有較好的代表性。

其他菌株：擬態(tài)弧菌VibriomimicusATCC33653、創(chuàng)傷弧菌VibriovulnificusATCC27562，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；大腸埃希菌EscherichiacoliATCC 29877、枯草芽孢桿菌BacillussubtilisATCC6633、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538、沙門氏菌SalmonellaentericCMCC50760、植物乳桿菌LactobacillusplantarumZJ191、發(fā)酵乳桿菌LactobacillusfermentumZJ236，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器

7500實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)，賽默飛世爾科技有限公司；ABI 9700 PCR系統(tǒng)，賽默飛世爾科技有限公司；3K30臺式高速冷凍離心機(jī)，德國西格瑪有限公司；SW-CJ-2FD超凈臺，上海博迅公司；MJ PCT220 PCR儀，美國伯樂公司；7415 Nano核酸蛋白分析儀，英國捷恩維公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

將實(shí)驗(yàn)室保藏的175株副溶血性弧菌菌株，以2%的接種量接種到APW液體培養(yǎng)基(pH 8.5)，37 ℃培養(yǎng)18 h。擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌，以2%的接種量接種到LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h。植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌，以1%的接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h。

1.2.2 DNA提取

取含有副溶血性弧菌及對照菌株的培養(yǎng)液以10 000 r·min-1的速度離心2 min，用0.85%無菌生理鹽水清洗，使用UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組DNA分離試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取基因組DNA，用核酸蛋白分析儀檢測提取的DNA質(zhì)量和濃度。

1.2.3 RAPD-PCR擴(kuò)增

從175株副溶血性弧菌菌株中隨機(jī)選取13株進(jìn)行試驗(yàn)，以擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌為對照菌株，選用S1引物(5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’)進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增。RAPD-PCR反應(yīng)體系為25 μL: 1×PCR緩沖體系(50 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1Tris-HCl，pH值8.3)，3 mmol·L-1MgCl2，0.2 mmol·L-1dNTP，1.0 μmol·L-1S1引物，1 UTaq聚合酶及50 ng DNA模板。反應(yīng)程序：94 ℃ 變性1 min，60 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸35s，45個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重復(fù)3次。

1.2.4 副溶血性弧菌菌株特異PCR引物設(shè)計

經(jīng)RAPD-PCR檢測，在13株副溶血性弧菌中均發(fā)現(xiàn)了一個由S1引物擴(kuò)增的普通DNA片段，將此片段純化、克隆、測序，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計一對特異引物SF和SR。

1.2.5 設(shè)計引物的特異性和敏感性測試

從175株副溶血性弧菌菌株中隨機(jī)選取20株進(jìn)行試驗(yàn)，以擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌為對照菌株，選用設(shè)計的引物，采用1.2.3節(jié)所述的25.0 μL PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序： 94 ℃ 變性3 min，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，重復(fù)3次。

1.2.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測

在1.2.5節(jié)所述的PCR反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，加入1.25 μL SYBR綠色Ⅰ熒光染料(Sigma，5 mL)(20×)，從1.2.5節(jié)所選的20株副溶血性弧菌菌株中隨機(jī)挑選4株，以擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌為對照菌株，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR程序： 95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性25 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；75 ℃ 延伸30 s。

以連續(xù)稀釋10倍的已知量(5 fg～50 ng)的副溶血性弧菌基因組DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以副溶血性弧菌已知的菌落數(shù)對數(shù)值為橫坐標(biāo)、熒光定量PCR熒光信號的熒光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立副溶血性弧菌熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 實(shí)時熒光定量PCR方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

從杭州某水產(chǎn)市場采集新鮮蝦、蛤蜊、蟹等水產(chǎn)品20份，每份樣品用無菌水浸泡1 h，取1 g樣本接種10 mL APW溶液(1%生理鹽水、1%蛋白胨)，37 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，收集菌體，提取基因組DNA，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。同時，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.7—2013方法對樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性

經(jīng)核酸蛋白分析儀測定，所提取的副溶血性弧菌及對照菌株的DNAD280值都在1.6～1.8，可滿足試驗(yàn)要求。13株副溶血性弧菌和4株對照菌株的RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，13株副溶血性弧菌在605 bp處均有目的條帶產(chǎn)生，且條帶單純，而擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌中均無對應(yīng)條帶擴(kuò)增，說明605 bp的條帶是副溶血性弧菌的特異性擴(kuò)增片段。

2.2 副溶血性弧菌特異PCR引物設(shè)計與驗(yàn)證

取2.1節(jié)所述的605 bp片段進(jìn)行純化、克隆、測序，將其核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，與副溶血性弧菌RIMD 2210633 DNA(GenBank登錄號為BA000031)的一致性為99%，在副溶血性弧菌基因組中，僅發(fā)現(xiàn)位于1 365 448～1 366 047 bp位置片段的一個副本。根據(jù)該片段序列，設(shè)計一對副溶血性弧菌特異性PCR引物：SF，5’-GTGACATTGACGCTTGGGATT-3’；SR，5’-TGATGGTGGACGCTTTC-3’。

選用設(shè)計的引物，對隨機(jī)挑選的20株副溶血性弧菌和4株對照菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，20株副溶血性弧菌在352 bp處均有目的條帶產(chǎn)生，而4株對照菌株中均無條帶擴(kuò)增，驗(yàn)證了所設(shè)計引物SF和SR的特異性。

Marker為DNA Marker DL2000，1～13為不同來源的副溶血性弧菌株，其他通道為對照菌株。箭頭所示為RAPD-PCR擴(kuò)增出的副溶血性弧菌特異性片段。Marker: DL2000. Lanes 1-13， V. parahaemolyticus strains from different sources; Control: The other lanes. The arrow indicated the specific fragment amplified from V. parahaemolyticus strains by RAPD-PCR.圖1 副溶血性弧菌及對照菌株的RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RAPD-PCR amplification result of V. parahaemolyticus and reference strains

隨機(jī)挑選4株副溶血性弧菌及8株對照菌株，以SF和SR為引物，實(shí)時定量PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖3所示，4株副溶血性弧菌均有特異性信號，而8株對照菌株均未觀察到信號。連續(xù)稀釋的DNA模板中，當(dāng)模板量為50 ng～50 fg時均可以檢測到信號，當(dāng)模板量進(jìn)一步降低到5 fg時，無信號產(chǎn)生(圖4)。經(jīng)測試，純化的DNA的最小檢測靈敏度為50 fg。

2.3 實(shí)時定量PCR檢測副溶血性弧菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以連續(xù)稀釋10倍的已知量的副溶血性弧菌基因組DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以副溶血性弧菌菌落數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.536x+38.04(R2=0.995 9)。

2.4 實(shí)時定量PCR方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的比較

分別利用本文構(gòu)建的實(shí)時定量PCR方法和國家標(biāo)準(zhǔn)中(GB 4789.7—2013)的平板菌落計數(shù)法對20份市售樣品進(jìn)行檢測(表1)。實(shí)時定量PCR在20份樣品中檢出副溶血性弧菌含量大于105CFU·mL-1的樣品2份，含量在103～104CFU·mL-1的樣品4份，陽性檢出率30%。經(jīng)檢驗(yàn)，2種方法的結(jié)果無顯著差異。實(shí)時定量PCR方法的檢測時間為1.5 h，而平板計數(shù)法的檢測時間在48～72 h，說明實(shí)時定量PCR方法檢測水產(chǎn)品中的副溶血性弧菌更加快速。

Marker為DNA Marker DL2000，1～20為不同來源的副溶血性弧菌菌株，其他通道為對照菌株。Marker: DL2000. Lanes 1-20， V. parahaemolyticus strains from different sources; Control， The other lanes.圖2 引物SF和SR檢測副溶血性弧菌的特異性Fig.2 Specificity test of primers SF and SR for detection of V. parahaemolyticus

樣本1～4，副溶血性弧菌；5，擬態(tài)弧菌；6，創(chuàng)傷弧菌；7，大腸埃希菌；8，枯草芽孢桿菌；9，金黃色葡萄球菌；10，沙門氏菌；11，植物乳桿菌；12，發(fā)酵乳桿菌。Sample 1-4， Vibrio parahemolyticus; 5， Vibrio mimicus ;6， Vibrio vulnificus; 7， Escherichia coli; 8， Bacillus subtilis; 9， Staphylococcus aureus;10， Salmonella enteric; 11， Lactobacillus plantarum; 12， Lactobacillus fermentum.圖3 實(shí)時PCR檢測引物SF和SR的特異性Fig.3 Specificity test of primers SF and SR for real time PCR assay

圖4 不同量的副溶血性弧菌DNA模板下熒光信號的動力學(xué)Fig.4 Kinetics of fluorescence signal at different quantities of template DNA of V. parahaemolyticus

3 討論

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，實(shí)時在線監(jiān)測整個PCR過程[9]，具有反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[10]。熒光定量PCR可以檢測多種致病菌，近年來，在農(nóng)業(yè)衛(wèi)生檢測診斷中得到了廣泛應(yīng)用：熒光定量PCR方法可以快速檢測原料乳中的大腸埃希菌，對原料乳中大腸埃希菌的檢測限為1.7×103CFU·mL-1[11]；采用熒光定量PCR法可快速檢測蔬菜中的沙門氏菌，沙門氏菌的最低檢出濃度為18 CFU·mL-1[12]。

圖5 實(shí)時定量PCR檢測副溶血性弧菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve for determination of V. parahaemolyticus by real-time PCR

表1 檢測樣品中副溶血性弧菌的計量結(jié)果(對數(shù)值)

關(guān)于副溶血性弧菌的檢測技術(shù)已有很多報道。有研究人員從副溶血性弧菌toxR基因中找出一段特異性高的序列設(shè)計PCR引物，建立一種常規(guī)的PCR檢測方法[13]；也有研究人員以tlh基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測牡蠣組織和地幔液中的副溶血性弧菌[14]；還有研究人員以副溶血性弧菌毒素基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過實(shí)時PCR方法測定海水和短頸蛤勻漿中的副溶血性弧菌，檢出限為36 CFU·mL-1[15]。本文采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析方法鑒定特異性片段，選取目的條帶，進(jìn)行克隆測序，設(shè)計出新的特異性引物，而此段序列還未被報道過。

經(jīng)對比，本文建立的實(shí)時定量PCR方法快速、高效，與國家標(biāo)準(zhǔn)中給定的方法相比，顯著縮短了檢測時間，整個檢測可在2 h內(nèi)完成，非常適用于水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的檢測，具有推廣及應(yīng)用價值。