新型抗肝癌化合物CBI-5725對(duì)RAF/MEK/ERK通路及癌細(xì)胞凋亡的影響

王 威，徐 波，閆素英*

0 引言

肝細(xì)胞癌(HCC)被認(rèn)為是世界第六大常見(jiàn)癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因[1]。并且，由于肝癌是由慢性肝病引起的，經(jīng)常在晚期時(shí)才被診斷出來(lái)，因此,藥物是晚期肝癌患者治療的主要手段之一。化療藥物如多柔比星是目前用于治療肝癌的主要藥物;然而，這些具細(xì)胞毒性的藥物是非選擇性的，并能引起嚴(yán)重的毒副作用[2]。因此，研究人員開(kāi)始研究靶向治療藥物。索拉非尼(Sorafenib)是唯一獲得批準(zhǔn)的適用于HCC患者的一線靶向藥物[2]。其通過(guò)抑制RAF激酶(突變體、野生型的B-RAF和C-RAF)，阻礙RAF/MEK/ERK信號(hào)通路，從而抑制腫瘤增殖[3]。此外，索拉非尼強(qiáng)烈抑制促進(jìn)血管生成的酪氨酸激酶受體(Receptor tyrosine kinase,RTK)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(VEGFR 3)、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-β(PDGFR-β)、Flt3和c-Kit[4]。除了阻斷RAF/MEK/ERK通路外，索拉非尼還能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5的凋亡，與caspase的活化無(wú)關(guān)[3]。盡管索拉非尼是可以延長(zhǎng)晚期HCC患者總生存時(shí)間的唯一可用的治療藥物，但隨之而來(lái)的耐藥性通常阻礙其長(zhǎng)期療效[5]。隨著索拉非尼的出現(xiàn)，研究者已經(jīng)對(duì)一系列藥物(主要是分子靶向藥物)進(jìn)行了臨床研究，然而，除了瑞格非尼(Regorafenib)、樂(lè)伐替尼(Lenvatinib)外，其他藥物試驗(yàn)均以失敗告終[6]。CBI-5725是一種新型雙芳基脲，中美冠科生物技術(shù)有限公司(Crown Bioscience Inc.China)擁有其專利。本研究，評(píng)估了該化合物的體外和體內(nèi)的抗肝癌作用，探討了CBI-5725的抗肝癌機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器 酶標(biāo)儀/分光光度計(jì)(德國(guó)Fluostar Optima BMG公司)；成像分析系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)；倒置顯微鏡(日本YMPUS IMT-2公司)；60 mm×15 mm組織培養(yǎng)皿(美國(guó)Nunclon)；凝膠電泳儀、濕式轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；EC3成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP)；普通離心機(jī)(德國(guó)Hettish Rotofix32公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.2 化合物與試劑 索拉非尼購(gòu)自Selleck (中國(guó)，上海藍(lán)木)，CBI-5725由中美冠科生物技術(shù)有限公司(Crown Bioscience Inc.China)合成。見(jiàn)圖1。化合物均溶解在100%的DMSO(德國(guó)AppliChem公司)中，并用含10%胎牛血清(奧地利PAA公司)的培養(yǎng)基MEM[中國(guó)邁晨科技(北京)有限公司]稀釋成不同濃度，并使DMSO最終濃度為0.1%。用DMSO作為溶劑對(duì)照處理細(xì)胞，最終濃度為0.1%(v/v)。AlamarBlue試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，0.1 mmol/L釩酸鹽購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，蛋白酶抑制劑混合片劑購(gòu)自瑞士Roche公司，RIPA裂解緩沖液購(gòu)自美國(guó)Applgene公司，牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司，磷酸化B-RAF(pB-RAF)、磷酸化C-RAF(pC-RAF)、磷酸化MEK(p-MEK)、磷酸化ERK(p-ERK)、相應(yīng)的非磷酸化蛋白、GAPDH、caspase-3和PARP抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工Sangon Biotech公司。

圖1 CBI-5725化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.3 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PLC/PRF/5細(xì)胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)液,臨用時(shí)加入10%的胎牛血清，然后置于37 ℃ 溫箱，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2 AlarmaBlue檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化液消化制成單細(xì)胞懸液，以最佳濃度5×104/ml 接種于無(wú)菌96孔培養(yǎng)板中，100 μl/孔，各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。棄掉原培養(yǎng)液，用PBS清洗一遍，再加入按3倍倍比稀釋成不同濃度(0、0.007 6、0.022 9、0.068 6、0.205 8、0.617 3、1.85、5.55、16.7、50 μmol/L)的索拉非尼或CBI-5725各100 μl,并使DMSO最終濃度為0.1%，溶劑對(duì)照組加入0.1%(v/v)的DMSO。每一濃度均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h,每孔加入AlarmaBlue 10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。用多功能酶標(biāo)儀在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的熒光強(qiáng)度值。繪制熒光強(qiáng)度值與藥物濃度之間的曲線，計(jì)算IC50。

2.3 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK1/2、caspase-3、PARP、Akt蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化液消化制成單細(xì)胞懸液，以6×105個(gè)細(xì)胞/皿的密度接種于60 mm×15 mm組織培養(yǎng)皿中。置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。之后，將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌一次，并用不同濃度的索拉非尼或CBI-5725處理2 h。用含有0.1 mmol/L釩酸鹽的預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞以抑制脫磷酸化，然后用含有蛋白酶抑制劑混合片劑的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。離心裂解物后，將90 μg可溶性蛋白質(zhì)經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。采用半干式電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯膜，在10%牛血清白蛋白(BSA)(磷酸化蛋白質(zhì))或10%脫脂奶室溫封閉轉(zhuǎn)印1 h，放入雜交袋中，加入一抗稀釋液(1∶1 000)，封口，4 ℃孵育過(guò)夜，隨后洗膜3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫放置1 h后洗膜3次，每次10 min。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法處理膜，并通過(guò)EC3成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)。用Image-Pro Plus Version 6.0軟件進(jìn)行分析，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25%胰酶消化液消化制成單細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。用不同濃度的化合物處理細(xì)胞24 h 或48 h，細(xì)胞凋亡刺激完畢后，離心，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后重懸于500 μl結(jié)合緩沖液中。 向細(xì)胞中加入5 μl的Annexin V-FITC，并在室溫下溫育10 min。 隨后，加入5 μl碘化丙啶(PI)，將細(xì)胞避光孵育10 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 小鼠腫瘤模型實(shí)驗(yàn) 雄性NCr-nu/nu小鼠，5周齡，購(gòu)自Vital River(中國(guó)北京)公司。小鼠被安置并隨意接受水和食物。根據(jù)宣武醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行使用這些小鼠的實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PLC/PRF/5細(xì)胞，用胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen，USA)消化制成單細(xì)胞懸液。PLC/PRF/5細(xì)胞(5×106)懸浮于含50%基質(zhì)膠(BD Biosciences，USA)的無(wú)血清培養(yǎng)基中，被注射入每只老鼠的背側(cè)。甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib tosylate)和CBI-5725溶解于聚氧乙烯蓖麻油EL(Cremophor EL)/95%乙醇(50∶50; Sigma-Aldrich，USA)中。當(dāng)PLC/PRF/5腫瘤達(dá)到200～220 mm3時(shí)，口服給藥，每日1次，持續(xù)14 d，劑量為甲苯磺酸索拉非尼(Sorafenib tosylate)8 mg/kg或20 mg/kg，CBI-5725 2 mg/kg或6 mg/kg或15 mg/kg。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤，通過(guò)測(cè)量最長(zhǎng)(a)和最短(b)直徑來(lái)確定腫瘤體積，并使用公式a×b2×π/6來(lái)計(jì)算腫瘤體積。

3 結(jié)果

3.1 CBI-5725對(duì)細(xì)胞增殖的影響 在本研究中，采用AlamarBlue測(cè)定索拉非尼或CBI-5725對(duì)人肝癌PLC/PRF/5細(xì)胞系增殖的抑制作用。不同濃度索拉非尼或CBI-5725對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞增殖的影響見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，兩種藥物均能明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且，隨著劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)，具有濃度依賴性。在本研究中，CBI-5725作用于PLC/PRF/5細(xì)胞系的IC50是(0.83±0.09)μmol/L，索拉非尼作用于PLC/PRF/5細(xì)胞系的IC50是(4.99±0.13)μmol/L，CBI-5725對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞的抑制效果高于索拉非尼，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 CBI-5725或索拉非尼對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞的抑制作用

3.2 CBI-5725對(duì)細(xì)胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt蛋白表達(dá)的影響 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞增殖、存活和分化的關(guān)鍵信號(hào)蛋白[7]。 MAPK通路通過(guò)三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)的形式傳導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)，即從RAF激酶→MEK激酶→ERK激酶發(fā)起的級(jí)聯(lián)磷酸化過(guò)程[8]。MAPK信號(hào)通路的失調(diào)在肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[9]。蛋白表達(dá)圖見(jiàn)圖3，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。每個(gè)磷酸化蛋白與內(nèi)參蛋白的比例通過(guò)單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)。如圖3所示，在2 h 作用時(shí)間下，與對(duì)照組相比，索拉非尼或CBI-5725對(duì)pB-RAF的表達(dá)均沒(méi)有影響，但均能使pC-RAF表達(dá)水平隨著化合物濃度的增加而顯著增加。雖然CBI-5725和索拉非尼都增強(qiáng)了C-RAF的磷酸化，但兩者都以劑量依賴性方式抑制MEK和ERK的磷酸化，表明CBI-5725和索拉非尼都是泛RAF激酶抑制劑。

無(wú)論是CBI-5725還是索拉非尼,都沒(méi)有影響總的RAF、MEK、ERK和Akt表達(dá)，而且Akt的磷酸化也沒(méi)有發(fā)生變化。圖4顯示，CBI-5725和索拉非尼對(duì)RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的抑制作用比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 CBI-5725對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞凋亡的影響 為了確定細(xì)胞周期停滯表型是否與凋亡誘導(dǎo)相關(guān)，采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。用Annexin V-FITC和碘化丙啶染色后，正常的活細(xì)胞不被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色；凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-FITC染色，碘化丙啶染色呈陰性；壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時(shí)被Annexin V-FITC和碘化丙啶染色[10]。總的凋亡細(xì)胞比例是早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞占所有細(xì)胞百分比的總和[11]。如圖5所示，24 h、48 h后，各處理組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P<0.01)。CBI-5725 5、15 μmol/L處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率均高于處理24 h時(shí)，且15 μmol/L組高于5 μmol/L組(P<0.01)，表明CBI-5725呈濃度依賴性發(fā)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；處理24 h、48 h后，CBI-5725 15 μmol/L組細(xì)胞凋亡率高于索拉非尼15 μmol/L組(P<0.01)。

圖3 PLC/PRF/5各組細(xì)胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt、GAPDH蛋白的表達(dá)

圖4 PLC/PRF/5細(xì)胞中pB-RAF、pC-RAF、pMEK、pERK、pAkt蛋白表達(dá)的光密度分析

圖5 PLC/PRF/5細(xì)胞中CBI-5725或索拉非尼介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

注：與對(duì)照組比較，* *P<0.01; 與CBI-5725 15 μmol/L比較，##P<0.01

3.4 CBI-5725對(duì)細(xì)胞中caspase-3前體、PARP及切割后的PARP片段的表達(dá)的影響 蛋白表達(dá)及測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖6， 對(duì)目的蛋白灰度值與內(nèi)參 GAP-DH灰度值的比值進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，然后進(jìn)行Tukey事后檢驗(yàn)。如圖6所示，用CBI-5725處理細(xì)胞48 h后，caspase-3前體和PARP的表達(dá)水平呈濃度依賴性的減低，切割后的PARP片段表達(dá)水平呈濃度依賴性的升高。然而，在用索拉非尼處理的細(xì)胞中，caspase-3前體、PARP及切割后的PARP片段的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。CBI-5725 15 μmol/L組caspase-3前體和PARP的水平遠(yuǎn)低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.01)，但切割后的PARP片段表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.01)。然而，索拉非尼15 μmol/L組上述指標(biāo)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)到的細(xì)胞凋亡結(jié)果一致。結(jié)果表明，CBI-5725能更好地引起caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這可能是本品能更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原因。

3.5 CBI-5725抑制PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型的腫瘤生長(zhǎng) 為了驗(yàn)證CBI-5725對(duì)PLC/PRF/5細(xì)胞的作用是否具有臨床相關(guān)性，我們用HCC小鼠腫瘤模型以評(píng)估并比較CBI-5725與索拉非尼的體內(nèi)效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中使用的每只小鼠中均觀察到單個(gè)腫瘤，每個(gè)治療組相對(duì)于對(duì)照組體重沒(méi)有增加。如圖7B所示，CBI-5725顯著抑制PLC/PRF/5腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)照組的最大腫瘤直徑為21 mm，2 mg/kg CBI-5725在治療結(jié)束時(shí)抑制約73%的腫瘤生長(zhǎng)(最大腫瘤直徑為13.4 mm)，6、18 mg/kg CBI-5725分別抑制89%、92%的腫瘤生長(zhǎng)(最大腫瘤直徑分別為10.7、10.3 mm)。另一方面，圖6A顯示，甲苯磺酸索拉非尼以劑量依賴性方式抑制PLC/PRF/5腫瘤生長(zhǎng)。在劑量為10、20 mg/kg時(shí)，索拉非尼分別抑制19%和64%的腫瘤生長(zhǎng)(最大腫瘤直徑分別為19.5、15 mm)。

圖6 PLC/PRF/5各組細(xì)胞中Caspase-3前體、PARP及切割后的PARP片段的表達(dá)(*P<0.05，**P<0.01)

4 討論

索拉非尼是一種多激酶抑制劑，是唯一批準(zhǔn)用于HCC患者的一線靶向藥物。然而，HCC中索拉非尼耐藥性的增加降低了其療效[12]。最近研究表明，多激酶抑制劑樂(lè)伐替尼和瑞格非尼分別到達(dá)了一線和二線治療的主要終點(diǎn)，其中瑞格非尼是目前唯一被FDA批準(zhǔn)的治療HCC的二線藥物。3種藥物的作用靶點(diǎn)、生存期、不良反應(yīng)等見(jiàn)表1[13]。

本研究中，與索拉非尼相比，CBI-5725更有效地阻止了人類HCC細(xì)胞系的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 CBI-5725阻斷RAF/MEK/ERK通路，并誘導(dǎo)依賴于caspase-3/PARP活化的細(xì)胞凋亡。 此外，CBI-5725通過(guò)抑制PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)發(fā)揮了強(qiáng)大的抗腫瘤活性。 因此，CBI-5725是替代索拉非尼治療HCC的潛在治療選擇。

圖7 CBI-5725(B)或sorafenib(A)對(duì)PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型的作用(***P<0.001)

RAF激酶是MEK/ERK激酶的重要調(diào)節(jié)者，RAF/MEK/ERK的信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)正常細(xì)胞增殖和存活所需要的多種生理功能。然而，該信號(hào)通路的過(guò)度激活誘導(dǎo)了人類腫瘤中異常的細(xì)胞生長(zhǎng)。RAF/MEK/ERK通路的信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[3]。RAF激酶活性與癌癥密切相關(guān)，在過(guò)去的十年中已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種ATP競(jìng)爭(zhēng)性的RAF激酶抑制劑[14]。 當(dāng)上游的RAS發(fā)生致癌突變時(shí)，選擇性B-RAF激酶抑制劑，如維羅非尼(Vemurafenib)和達(dá)拉非尼(Dabrafenib),與RAF異二聚體(C-RAF/B-RAF)中的一員結(jié)合，這樣的結(jié)合抑制了二聚體中的一員，但是反式激活了無(wú)藥物結(jié)合的另一員[15],因此，選擇性B-RAF抑制劑能夠激活C-RAF和隨后的ERK信號(hào)傳導(dǎo)，反而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖。為了規(guī)避選擇性B-RAF激酶抑制劑的限制，一系列泛RAF激酶抑制被開(kāi)發(fā)出來(lái)，如索拉非尼[16]。索拉非尼是一種泛RAF激酶抑制劑，其抑制BRAF激酶并驅(qū)動(dòng)CRAF激活，但其同時(shí)結(jié)合并抑制CRAF激酶，因此不激活ERK[17]。本研究中采用的PLC/PRF/5細(xì)胞系，具有K-RAS-mutant及B-RAF wild type的基因表型，推測(cè)該細(xì)胞癌變的原因與MAPK通路受干擾有關(guān)。本研究顯示，RAF/MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)CBI-5725或索拉非尼的敏感性相當(dāng)。CBI-5725不激活ERK，因此，其可能與索拉非尼一樣，是泛RAF激酶抑制劑，且抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的效果與索拉非尼類似。

在本研究中，Annexin V-FITC/PI檢測(cè)了CBI-5725誘導(dǎo)的劑量依賴性的PLC/PRF/5細(xì)胞凋亡，且CBI-5725比索拉非尼更能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspases是細(xì)胞凋亡途徑的基礎(chǔ)，是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者。Caspases可以通過(guò)兩種常見(jiàn)的途徑被激活。內(nèi)在和外在途徑都匯集于下游的Caspase-3。一旦被激活，caspase-3前體被切割，產(chǎn)生了caspase-3的活性形式，負(fù)責(zé)切割PARP[18-20]。 PARP在轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷反應(yīng)、凋亡和基因組完整性維護(hù)方面起重要作用[21]。 PARP的切割促進(jìn)細(xì)胞破壞，并且是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[22]。用CBI-5725處理細(xì)胞后，caspase-3前體和PARP水平降低，而切割的PARP片段水平升高，表明CBI-5725依賴caspases途徑在PLC/PRF/5細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。然而，索拉非尼沒(méi)有顯著改變caspase-3前體、PARP和切割的PARP片段的水平，表明索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能不依賴caspases的活化。這個(gè)結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致[3]。

在PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型中，CBI-5725可有效防止腫瘤生長(zhǎng)。在口服給藥14 d后，6～18 mg/kg 的CBI-5725幾乎完全抑制腫瘤的生長(zhǎng)。 另一方面，甲苯磺酸索拉非尼在劑量高達(dá)20 mg/kg時(shí)，仍未完全抑制腫瘤生長(zhǎng)。從體外實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果提示，RAF/MEK/ERK信號(hào)通路的阻斷和細(xì)胞凋亡可能是CBI-5725抑制PLC/PRF/5小鼠腫瘤模型的腫瘤生長(zhǎng)的原因。

表1 不可切除肝細(xì)胞癌分子靶向治療

總之，本研究表明，CBI-5725抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)通路，效果與索拉非尼近似，CBI-5725比索拉非尼更能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與啟動(dòng)caspase-3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。這些因素都使得CBI-5725比索拉非尼更能有效地抑制PLC/PRF/5的增殖。這些因素可能有助于CBI-5725對(duì)人類HCC小鼠腫瘤模型的顯著抗腫瘤功效。 因此，CBI-5725可能成為一種有效的抗腫瘤藥物，替代索拉非尼用于肝癌患者。