高純度亞麻木酚素的分離純化和分析

王 尉，賀天雨，趙新穎,*，席興軍，蘭 韜，杜 寧，張經(jīng)華

（1.北京市理化分析測試中心，北京 100089；2.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191）

亞麻（Linum usitatissimum L.）又稱胡麻，與花生、大豆等同屬重要的油料作物[1]，其種子、種皮中木酚素含量最高，約為其他植物的75～800 倍[2]。同時，亞麻還是重要的纖維制造原料之一，因此作為重要的生產(chǎn)和生活材料，人們對于亞麻的研究十分重視且從未間斷。自1956年Bakke等[3]首次將亞麻木酚素從亞麻籽中分離出來，科技工作者便對亞麻的藥用價值進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究。據(jù)報道，亞麻木酚素具有較強的抗氧化活性[4-6]和抗炎作用[7]，對糖尿病[8-9]、心血管疾病[10-12]、腎臟病[13-14]，尤其是對于乳腺癌[15-20]、經(jīng)期綜合征、骨質(zhì)疏松[21-22]等雌激素依賴性疾病有較好的預(yù)防作用。近年來，亞麻木酚素提取物產(chǎn)品已經(jīng)廣泛用于膠囊壓片、谷物早餐和快餐食品的添加劑[23]。因此，開發(fā)高效、簡單的高純度亞麻木酚素分離分析技術(shù)對于充分發(fā)揮亞麻的應(yīng)用價值具有重要的意義。

目前，亞麻木酚素的制備工藝多集中于提取方法及大孔吸附樹脂純化等方面的研究[24-27]，其制備所得的亞麻木酚素純度不高，鮮有高純度亞麻木酚素分離純化的報道。此外，亞麻木酚素的純度或含量的分析方法也僅限于單一條件的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法或紫外分光光度法等[1]，并不能全面、準(zhǔn)確反映樣品中雜質(zhì)含量的情況。本研究通過正己烷脫脂、乙醇提取、大孔吸附樹脂初步分離、高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）純化等方法制備得到高純度的亞麻木酚素，方法簡單可行；綜合利用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）以及多種HPLC條件和聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行純度分析，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。最后通過紫外光譜（ultraviolet spectrum，UV）、紅外光譜（infrared spectrum，IR）、高分辨質(zhì)譜（high-resolution mass spectrometry，HRMS）、核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）和元素分析等方法對亞麻木酚素進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

圖 1 亞麻木酚素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical formula of flax lignan

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥亞麻籽 市售。

正己烷、乙醇、叔丁基甲醚、正丁醇、氯仿、乙腈、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientific科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TBE-300B高速逆流色譜儀 上海同田生物技術(shù)有限公司；LC-20A HPLC系統(tǒng)（配SPD-M20A和ELSD-LTII檢測器）、UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；PerkinElmer spectrum 400傅里葉變換紅外-近紅外光譜儀 美國珀金埃爾默公司；Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀美國Thermo公司；DD2 600 MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀美國Aglient公司；Vario EL III全自動元素分析儀 德國Elementar公司。

1.3 方法

1.3.1 亞麻木酚素的提取及分離純化

1.3.1.1 樣品的提取

將亞麻籽粉碎后過40 目篩，稱取100.0 g按照料液比1∶20（g/mL）加入正己烷，室溫浸泡脫脂6 h。對脫脂后的樣品按料液比1∶20（g/mL）加入乙醇，超聲波輔助提取3 次，離心分離，合并上清液。在上清液中加入6 mol/L NaOH溶液至最終NaOH濃度為0.25 mol/L，室溫堿解2 h后，加入6 mol/L HCl溶液中和至pH 4.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，可得亞麻籽水解物9.6 g。

1.3.1.2 分離純化

首先，采用AB-8大孔吸附樹脂對亞麻籽水解物進(jìn)行初步分離，依次使用蒸餾水和80%乙醇溶液洗脫，收集80%乙醇溶液洗脫產(chǎn)物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，可得亞麻籽初步分離樣品105 mg。然后，采用HSCCC對該樣品進(jìn)行純化，溶劑體系為叔丁基甲醚-正丁醇-乙腈-水（1∶3∶1∶5，V/V），轉(zhuǎn)速900 r/min，流速1.2 mL/min，分離溫度25 ℃，檢測波長280 nm。根據(jù)HSCCC圖譜收集目標(biāo)化合物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，冷凍干燥后得到高純度亞麻木酚素樣品58 mg。

1.3.2 純度分析

1.3.2.1 TLC純度分析

分別采用兩種展開條件對亞麻籽提取物和亞麻木酚素進(jìn)行TLC純度分析，展開劑分別為乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（77∶13∶10∶5，V/V）和氯仿-甲醇-乙酸（8∶4∶0.5，V/V），顯色劑為5%硫酸-乙醇溶液，噴灑后于105 ℃加熱顯色。

1.3.2.2 多種HPLC條件純度分析

在流動相A為乙腈，B為1%甲酸，流速1.0 mL/min、柱溫35 ℃條件下，對HPLC洗脫條件、不同色譜柱、高效液相色譜-二極管陣列檢測器-蒸發(fā)光散射檢測器（high performance liquid chromatography-diode array detectorevaporative light scattering detector，HPLC-DAD-ELSD）聯(lián)用等方法對亞麻木酚素進(jìn)行純度分析，并采用峰面積歸一化法計算純度。

1.3.2.3 HPLC-MS聯(lián)用純度分析

采用HPLC-MS的正、負(fù)離子模式對亞麻木酚素進(jìn)行純度分析。HPLC條件：色譜柱：ACQUITY UPLC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為乙腈，B為0.3%甲酸，0～10 min，20% A；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；運行時間：10 min。MS條件：錐孔氣流速40 L/min；毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑溫度320 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 150～2 000。

1.3.3 結(jié)構(gòu)鑒定

對分離純化后的樣品通過UV、IR、HRMS、NMR和元素分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。UV分析條件：甲醇作為溶劑，掃描范圍200～400 nm；IR分析條件：KBr壓片法，掃描范圍400～4 000 cm-1；MS分析條件同HPLC-MS聯(lián)用純度分析；NMR分析條件：氘代溶劑為氘代甲醇（CD3OD），采集13C-NMR和1H-NMR圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻木酚素的提取及分離純化

首先，對粉碎后亞麻籽樣品采用正己烷脫脂、乙醇超聲波輔助提取得到亞麻籽提取物樣品。由于亞麻籽中部分亞麻木酚素會與3-羥基-3-甲基-戊二酸形成絡(luò)合物[28-29]，為提高提取效率，采用堿水解[30-31]的方式有利于釋放更多亞麻木酚素成分，故通過NaOH堿水解，HCl中和后制備得到亞麻籽水解物。然后，對該樣品采用AB-8大孔吸附樹脂初步分離，收集80%乙醇洗脫產(chǎn)物得到亞麻籽初步分離樣品。最后，采用HSCCC叔丁基甲醚-正丁醇-乙腈-水（1∶3∶1∶5，V/V）溶劑體系純化得到亞麻木酚素樣品（圖2），對以上得到的亞麻籽提取物、亞麻籽初步分離、亞麻木酚素3 個樣品經(jīng)HPLC分析，采用峰面積歸一法計算純度，其純度分別為8.7%、90.1%、99.4%（圖3）。

圖 2 亞麻木酚素的HSCCC圖Fig. 2 HSCCC chromatogram of flax lignan

圖 3 亞麻木酚素的HPLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of flax lignan

2.2 純度分析

2.2.1 TLC純度分析

分別采用兩種展開條件對亞麻籽提取物（圖4，點樣位置1）和3 種濃度樣品亞麻木酚素（圖4，點樣位置2、3、4）進(jìn)行TLC純度分析。展開劑為乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（77∶13∶10∶5，V/V）的Rf值為0.36，展開劑為氯仿-甲醇-乙酸（8∶4∶0.5，V/V）的Rf值為0.60，通過實驗結(jié)果可知，未在TLC譜圖中發(fā)現(xiàn)其他雜質(zhì)斑點，表明分離純化所得亞麻木酚素的純度較高。

圖 4 亞麻木酚素的TLC圖Fig. 4 TLC analysis of flax lignan

2.2.2 多種HPLC條件純度分析

為全面反映雜質(zhì)的情況，需要采用多種HPLC條件對目標(biāo)物進(jìn)行分析。本實驗比較恒定洗脫、梯度洗脫、色譜柱類型、HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用的方法，并采用峰面積歸一化法對亞麻木酚素進(jìn)行純度分析，結(jié)果見表1。實驗結(jié)果表明，多種方法測得的目標(biāo)物純度基本一致，均高于99%，其中HPLC-DAD-ELSD聯(lián)用譜圖見圖5、6。

表 1 不同HPLC條件分析結(jié)果Table 1 Results of HPLC analysis under different conditions

圖 5 亞麻木酚素的DAD譜圖Fig. 5 DAD spectrum of flax lignan

圖 6 亞麻木酚素的ELSD色譜圖Fig. 6 ELSD chromatogram of flax lignan

圖 7 亞麻木酚素的總離子流色譜圖Fig. 7 Total ion current chromatograms of flax lignan

2.2.3 HPLC-MS聯(lián)用純度分析采用正、負(fù)離子兩種模式對亞麻木酚素進(jìn)行純度分析。通過實驗結(jié)果（圖7）可知，未在總離子流譜圖中發(fā)現(xiàn)其他雜質(zhì)峰存在。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

表 2 亞麻木酚素的1H-NMR數(shù)據(jù)Table 2 1H-NMR data of flax lignan

表 3 亞麻木酚素的13C-NMR數(shù)據(jù)Table 3 13C-NMR data of flax lignan

分離純化后樣品經(jīng)元素分析結(jié)果顯示：C：56.2%，H：6.5%，與亞麻木酚素的元素組成計算值（C：56.0%，H：6.7%）相符。UV最大吸收波長為281 nm（甲醇溶劑）；IR吸收峰為3 406 cm-1（-OH伸縮振動）、2 929 cm-1（C-H伸縮振動）、1 604、1 516、1 430 cm-1（芳環(huán)骨架振動）、1 272、1 076、1 031 cm-1（C-O伸縮振動）（圖8），UV、IR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]比較，光譜特征一致。如圖9所示，HRMS正離子模式給出m/z 709.266 1[M+Na]+（C32H46O16Na精確分子質(zhì)量計算值：m/z 709.268 4），m/z 327.158 4[M-2glu-2H2O+H]+（C20H23O4精確分子質(zhì)量計算值：m/z 327.159 6），負(fù)離子模式給出m/z 731.276 7[M+COOH]-（C33H47O18精確分子質(zhì)量計算值：m/z 731.276 2），m/z 685.270 6[M-H]-（C32H45O16精確分子質(zhì)量計算值：m/z 685.270 8），以上數(shù)據(jù)均與亞麻木酚素精確分子質(zhì)量相符。通過1H-NMR和13C-NMR鑒定（表2、3和圖10），并與文獻(xiàn)[32-33]比較，其核磁譜數(shù)據(jù)與報道的亞麻木酚素化合物一致，確定該樣品為亞麻木酚素。

圖 8 亞麻木酚素的UV和IR的光譜圖Fig. 8 UV and IR spectra of flax lignan

圖 9 亞麻木酚素的HRMS圖Fig. 9 HRMS spectra of flax lignan

圖 10 亞麻木酚素的NMR圖Fig. 10 NMR spectra of flax lignan

3 結(jié) 論

本實驗建立了從亞麻籽中分離純化亞麻木酚素的方法，通過大孔吸附樹脂和HSCCC兩步分離純化即可得到純度在99.3%～99.5%之間高純度亞麻木酚素，方法簡單可行。這將有效促進(jìn)亞麻藥理活性的深入研究，推動亞麻木酚素對照品的廣泛研制，提升亞麻相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量品質(zhì)，進(jìn)一步提高亞麻作物的經(jīng)濟(jì)價值。同時，本研究所采用的多種分析技術(shù)組合的純度分析方法，也對制備其他高純度天然產(chǎn)物單體具有一定的借鑒作用。