基于滋味成分HPLC指紋圖譜的判別分析及相似度評(píng)價(jià)在信陽(yáng)毛尖茶分等定級(jí)中的應(yīng)用

王淑慧，宋沙沙，曹學(xué)麗*

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

中國(guó)是茶葉的發(fā)源地，栽培歷史悠久，種植幅員遼闊，種類繁多，制法工藝不斷推陳出新。信陽(yáng)毛尖茶是中國(guó)的十大名茶之一，屬炒青綠茶[1]。其外形細(xì)、圓、光、直，鋒苗挺秀，色澤翠綠光潤(rùn)，白毫顯露；內(nèi)質(zhì)湯色嫩綠明亮，香氣鮮濃持久，有熟板栗香，滋味鮮濃、爽口、回甘生津，葉底嫩綠明亮、勻整[2]。目前，對(duì)茶葉分等定級(jí)的方法以感官評(píng)審為主[3]，該方法依賴評(píng)茶師的評(píng)茶經(jīng)驗(yàn)，存在很大的主觀性，使茶葉的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，市面上的茶葉品質(zhì)魚龍混雜。因此，研究茶葉品質(zhì)的科學(xué)評(píng)定方法和質(zhì)量監(jiān)測(cè)體系，對(duì)于促進(jìn)茶葉產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

茶湯中的主要化學(xué)成分有多酚、咖啡堿、茶多糖、茶氨酸、碳水化合物和維生素等[4]，對(duì)茶葉的品質(zhì)[5-6]和滋味[7-11]具有重要貢獻(xiàn)。在感官評(píng)審中，茶湯滋味對(duì)茶葉感官評(píng)審的貢獻(xiàn)率達(dá)30%～35%，占最主要位置[3]。因此，茶葉滋味的研究具有重大意義。指紋圖譜技術(shù)主要應(yīng)用于鑒別中藥的真?zhèn)魏唾|(zhì)量控制等[12-14]，近年來(lái)被應(yīng)用到茶葉的質(zhì)量控制中[15-16]。本研究將指紋圖譜技術(shù)用于茶葉分等定級(jí)和質(zhì)量控制中，以信陽(yáng)毛尖為研究對(duì)象，采用高效液相色譜（high performance liqulid chromatography，HPLC）技術(shù)，通過(guò)建立信陽(yáng)毛尖茶滋味成分HPLC指紋圖譜，對(duì)茶湯滋味成分進(jìn)行分析，將判別分析法與指紋圖譜相似度法相結(jié)合，用于確定不同等級(jí)茶樣之間的差異性，為綠茶客觀品質(zhì)評(píng)價(jià)和質(zhì)量監(jiān)控建立一種科學(xué)量化的方法。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

供試茶樣為2014年4—5月的信陽(yáng)毛尖茶，均來(lái)自信陽(yáng)市文新茶葉有限責(zé)任公司，包括優(yōu)質(zhì)信陽(yáng)毛尖茶“道”系列4 個(gè)等級(jí)多個(gè)批次的22 個(gè)茶樣，按等級(jí)從高到低依次為觀道（5 個(gè)批次）、悟道（5 個(gè)批次）、修道（6 個(gè)批次）和品道（6 個(gè)批次）；普通信陽(yáng)毛尖茶“300”系列3 個(gè)等級(jí)多個(gè)批次的19 個(gè)茶樣，按等級(jí)從高到低依次為330（6 個(gè)批次）、320（7 個(gè)批次）和310（6 個(gè)批次）。用復(fù)合鋁箔袋密封樣品，保存于4 ℃冰箱中，冷藏待用。

樣品的等級(jí)評(píng)定由具有資質(zhì)的品茶師按照GB/T 22737—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 信陽(yáng)毛尖茶》[17]中對(duì)不同級(jí)別信陽(yáng)毛尖茶的文字標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合GB/T 23776—2009《茶葉感官審評(píng)方法》[3]完成。樣品的分析工作于2014年底完成。

乙腈（色譜級(jí)） 美國(guó)Fisher科學(xué)公司；磷酸（色譜級(jí)） 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 HPLC儀（配有四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、Chem Station色譜工作站等）美國(guó)Agilent公司；Atlantis T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱 美國(guó)Waters公司；150 mL專業(yè)茶葉審評(píng)杯 景德鎮(zhèn)陶瓷。

1.3 方法

1.3.1 茶湯制備

茶湯的制備按照GB/T 23776—2009[3]沖泡綠茶的程序進(jìn)行：稱量3 g綠茶樣品于150 mL評(píng)茶杯中，倒入150 mL沸水，蓋上杯蓋沖泡5 min后，將茶湯濾出，待茶湯的溫度降低后，取一定量的茶湯過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.2 茶湯滋味指紋圖譜建立

分別稱取各批次信陽(yáng)毛尖樣品5 份，按照1.3.1節(jié)方法進(jìn)行茶湯制備。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的前期研究[18]，采用HPLC分析方法：色譜柱：Waters-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.04%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～60 min，4%～25% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。每份信陽(yáng)毛尖茶樣品均做3 針平行實(shí)驗(yàn)。將所獲得的同一等級(jí)的液相色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723版本），生成相應(yīng)等級(jí)茶葉的HPLC指紋圖譜。

1.3.3 茶樣判別分析

分別以2 個(gè)系列信陽(yáng)毛尖為研究對(duì)象，采用判別分析法進(jìn)行等級(jí)判別。根據(jù)前期研究成果[18]，篩選15 種共有特征滋味成分，如表1所示。將所得到的每個(gè)樣品色譜圖中含量最高的共有峰峰面積為參照，計(jì)算其他共有峰相對(duì)峰面積，以相對(duì)峰面積作為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件，采用輸入自變量方法中的Wilks λ法進(jìn)行判別分析，建立判別方程，驗(yàn)證判別方程對(duì)初識(shí)分組的分類結(jié)果[19-21]。

表 1 信陽(yáng)毛尖茶湯15 種特征滋味成分Table 1 Fifteen characteristic flavor compounds in Xinyang Maojian tea infusion

1.3.4 指紋圖譜相似度計(jì)算

同種綠茶的分等定級(jí)屬于小類水平上的區(qū)別，所以選擇適合同種綠茶不同等級(jí)的相似度計(jì)算方法是體現(xiàn)差異的關(guān)鍵。綜合考慮文獻(xiàn)中多種相似度計(jì)算方法后，選擇夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、新模型負(fù)指數(shù)法、改進(jìn)Nei系數(shù)法、改良程度相似度、新改良程度相似度、Manhattan距離系數(shù)法7 種計(jì)算方法進(jìn)行同種綠茶不同等級(jí)之間相似度計(jì)算。當(dāng)兩圖譜的相對(duì)差異越小時(shí)，相似度系數(shù)的取值越接近于1，距離系數(shù)越小，即茶葉等級(jí)間的差異越小。

以優(yōu)質(zhì)信陽(yáng)毛尖“道”和普通信陽(yáng)毛尖“300”系列7 個(gè)等級(jí)多個(gè)批次樣品15 個(gè)特征滋味成分的HPLC平均峰面積為計(jì)算參數(shù)，利用Excel軟件的數(shù)據(jù)處理功能，以最高級(jí)別觀道茶樣指紋圖譜為計(jì)算參照，將各級(jí)計(jì)算得到的各特征峰的平均峰面積分別代入7 種相似度計(jì)算方法的公式中，得到各等級(jí)與最高級(jí)別的相似度。

1.3.4.1 夾角余弦法

夾角余弦系數(shù)法[22]是將兩系統(tǒng)A和B的信息轉(zhuǎn)化為兩向量的相互關(guān)系，所以系統(tǒng)在質(zhì)上和量上的區(qū)別分別對(duì)應(yīng)于向量中的方向和模長(zhǎng)。兩向量的夾角余弦見公式（1）：

式中：ai為系統(tǒng)A的第i個(gè)共有色譜峰的峰面積；bi為系統(tǒng)B的第i個(gè)共有峰的峰面積；n為系統(tǒng)中共有峰的個(gè)數(shù)。

1.3.4.2 相關(guān)系數(shù)法

相關(guān)系數(shù)法也稱為皮爾遜相關(guān)系數(shù)法[23]，是中心化了的夾角余弦，用于測(cè)試變量之間的相關(guān)性，是形狀測(cè)度，與夾角余弦法在本質(zhì)上一樣。相關(guān)系數(shù)法計(jì)算見公式（2）：

式中：a為系統(tǒng)A的所有共有峰峰面積的平均值；b為系統(tǒng)B的所有共有峰峰面積的平均值。

1.3.4.3 新模型負(fù)指數(shù)法

新模型負(fù)指數(shù)方法[24]原理借鑒向量夾角法的基本思路，某物質(zhì)在兩圖譜的相對(duì)差異為A圖譜中該物質(zhì)峰面積減去B圖譜中該物質(zhì)峰面積的值與B圖譜該物質(zhì)峰面積的比值；圖譜相似度的指標(biāo)參數(shù)為圖譜整體平均相對(duì)差異的負(fù)指數(shù)。新模型負(fù)指數(shù)法計(jì)算見式（3）：

1.3.4.4 改進(jìn)Nei系數(shù)法

改進(jìn)Nei系數(shù)法[25]是對(duì)峰重疊率法[26]的改進(jìn)，原理是在保證兩色譜具有相同的色譜峰數(shù)目的前提下（無(wú)峰的對(duì)應(yīng)位置記為0），按照峰在譜圖上的保留時(shí)間進(jìn)行排序，建立峰序號(hào)與其峰面積坐標(biāo)系，將每個(gè)系統(tǒng)的色譜點(diǎn)描成折線，成為色譜指紋特征曲線，將相比較的兩系統(tǒng)色譜指紋圖譜相似度記為兩色譜指紋特征曲線的重合率。計(jì)算見公式（4）：

式中：n1、n2分別為兩圖譜的總峰數(shù)；n為共有峰數(shù)。

1.3.4.5 改良程度相似度法

改良程度相似度法[27]是對(duì)程度相似度法[28]的改進(jìn)。程度相似度為各相似要素相似倍數(shù)的平均值，在實(shí)際應(yīng)用中，由于每個(gè)相似要素差異情況各不相同，因此對(duì)程度相似度的結(jié)果也會(huì)存在程度大小不同的影響。孟慶華等[25]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，并進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用，其計(jì)算見式（5）：1.3.4.6 新改良程度相似度法

詹雪艷等[29]在改良程度相似度的基礎(chǔ)上，指出改良程度相似度不能反映差異分布不同的兩樣本的相似度，提出新的計(jì)算方法見公式（6）：1.3.4.7 Manhattan距離系數(shù)法

距離系數(shù)體現(xiàn)的是總峰面積的差異或者總峰面積的平均差異，代表絕對(duì)距離上的差異大小，距離越大，兩者的差異越大，但是不能衡量相似關(guān)系遠(yuǎn)近的程度。距離系數(shù)在色譜指紋圖譜中的應(yīng)用，通常是以共有峰為計(jì)算對(duì)象，初步衡量樣本在量上的差異[30]，其計(jì)算見公式（7）：

2 結(jié)果與分析

2.1 信陽(yáng)毛尖茶HPLC指紋圖譜的建立

圖 1 “道”系列4 個(gè)等級(jí)信陽(yáng)毛尖茶HPLC指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprints of four grades of the “Dao” series of Xinyang Maojian tea

圖 2 “300”系列3 個(gè)等級(jí)信陽(yáng)毛尖茶HPLC指紋圖譜Fig. 2 HPLC fingerprints of three grades of the “300” series of Xinyang Maojian tea

從圖1、2可以看出，優(yōu)質(zhì)“道”系列在滋味物質(zhì)含量上要高于普通“300”系列，但“道”系列4 個(gè)等級(jí)間及“300”系列3 個(gè)等級(jí)間的差異并不能明顯看出。2 個(gè)系列7 個(gè)等級(jí)的信陽(yáng)毛尖茶湯15 種特征滋味成分的含量見表2。

2.2 基于滋味特征成分的信陽(yáng)毛尖茶等級(jí)判別分析

以信陽(yáng)毛尖茶“道”系列4 個(gè)等級(jí)22 個(gè)樣品和“300”系列3 個(gè)等級(jí)19 個(gè)樣品的15 個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0 建立典型判別函數(shù)，該方法對(duì)初始等級(jí)樣本中的95.1%進(jìn)行正確分類。從圖3可知，7 個(gè)不同等級(jí)的信陽(yáng)毛尖茶之間差異顯著，且普通信陽(yáng)毛尖“300”系列和優(yōu)質(zhì)信陽(yáng)毛尖“道”系列之間具有顯著差異，區(qū)分度也很好，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一品種不同等級(jí)信陽(yáng)毛尖茶的等級(jí)區(qū)分。表明利用茶湯滋味特征成分可以對(duì)普通和優(yōu)質(zhì)信陽(yáng)毛尖進(jìn)行很好的等級(jí)判別分析，且差異顯著。

表 2 信陽(yáng)毛尖2 個(gè)系列7 個(gè)等級(jí)茶的15 個(gè)特征滋味成分含量（以峰面積計(jì)）Table 2 Peak area of 15 characteristic flavor components in seven grades of two series of Xinyang Maojian tea

圖 3 基于HPLC指紋圖譜的信陽(yáng)毛尖茶“道”系列和“300”系列判別分析Fig. 3 Discriminant classification of two series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

分別以信陽(yáng)毛尖茶“道”系列22 個(gè)樣品和“300”系列19 個(gè)樣品按相同方法分別進(jìn)行判別分析，對(duì)初始分組樣品中的100%進(jìn)行正確分類。從圖4可以看出，“道”系列4 個(gè)等級(jí)之間具有顯著差異，區(qū)分度更好。從圖5可以看出，“300”系列3 個(gè)等級(jí)之間也具有顯著差異，區(qū)分度也很好。表明采用滋味特征成分可以對(duì)優(yōu)質(zhì)信陽(yáng)毛尖不同等級(jí)進(jìn)行很好的等級(jí)判別。

圖 4 基于HPLC指紋圖譜的信陽(yáng)毛尖茶“道”系列4 個(gè)等級(jí)判別分析Fig. 4 Discriminant classification of four grades of the “Dao” series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

圖 5 基于HPLC指紋圖譜的信陽(yáng)毛尖茶“300”系列3 個(gè)等級(jí)判別分析Fig. 5 The discriminant classification of three grades of the “300”series of Xinyang Maojian tea based on HPLC fingerprints

2.3 不同等級(jí)信陽(yáng)毛尖茶的HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

以最高級(jí)別觀道茶樣指紋圖譜為參照，計(jì)算得到的7 種相似度計(jì)算結(jié)果如表3所示。除距離系數(shù)法外，6 種相似度計(jì)算法對(duì)信陽(yáng)毛尖茶不同等級(jí)茶葉的區(qū)分度從夾角余弦法、相關(guān)系數(shù)法、改進(jìn)Nei系數(shù)法、新模型負(fù)指數(shù)、改良程度相似度法、新改良程度相似度法依次提高，新改良程度相似度法能最大程度地反映出不同等級(jí)信陽(yáng)毛尖之間的差距，且普通“300”與優(yōu)質(zhì)“道”系列間相似度較低，差異較大，可見“300”系列茶葉級(jí)別較低。采用該方法對(duì)茶葉進(jìn)行分等定級(jí)與市面等級(jí)相一致，且能計(jì)算出各等級(jí)間的差異大小，表明采用指紋圖譜相似度計(jì)算的方法能對(duì)茶葉進(jìn)行分等定級(jí)。

表 3 信陽(yáng)毛尖茶“道”和“300”系列HPLC指紋圖譜相似度計(jì)算Table 3 Similarity calculation of HPLC fingerprints for the “Dao” and“300” series of Xinyang Maojian tea

若僅對(duì)“道”系列4 個(gè)等級(jí)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，仍是新改良程度相似度法最能反映等級(jí)之間的差異程度。觀道與悟、修、品道間差異顯著，悟道與修道接近，它們與品道間的差異較小，但與實(shí)際的等級(jí)相一致。表明采用指紋圖譜相似度的方法能對(duì)優(yōu)質(zhì)信陽(yáng)毛尖茶進(jìn)行分等定級(jí)。

若對(duì)“300”系列3 個(gè)等級(jí)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單獨(dú)處理，以最高級(jí)別330指紋圖譜為計(jì)算參照，按上述相同的方法計(jì)算相似度，結(jié)果如表4所示，也是新改良程度相似度法最能反映等級(jí)之間的差異程度，3 個(gè)等級(jí)茶葉間的差異較小，但也能明顯區(qū)分，且與實(shí)際等級(jí)相一致。表明采用指紋圖譜相似度的方法能對(duì)普通信陽(yáng)毛尖茶也能進(jìn)行分等定級(jí)。

表 4 信陽(yáng)毛尖茶“300”系列HPLC指紋圖譜相似度Table 4 Similarity calculation of HPLC fingerprints for the “300”series of Xinyang Maojian tea

3 結(jié) 論

采用HPLC方法分別建立信陽(yáng)毛尖“道”系列和“300”系列共7 個(gè)等級(jí)茶葉滋味成分HPLC指紋圖譜，但同品種不同等級(jí)茶葉間的差異很難從其指紋圖譜中直接看出。因而本實(shí)驗(yàn)首先基于15 種滋味特征成分，采用判別分析法對(duì)2 個(gè)系列7 個(gè)等級(jí)41 個(gè)樣品進(jìn)行判別分析，其等級(jí)區(qū)分正確率為95.1%，分別對(duì)2 個(gè)系列的茶樣進(jìn)行判別分析，正確率則近100%，表明該方法能夠?qū)ν贩N茶葉進(jìn)行很好的等級(jí)區(qū)分判別。采用7 種指紋圖譜相似度計(jì)算方法對(duì)各等級(jí)茶葉間的相似度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示，各相似度計(jì)算方法均能在一定程度上反映茶葉等級(jí)間的差異大小，其中以新改良程度相似度法最佳，采用該方法對(duì)茶葉分等定級(jí)結(jié)果與其實(shí)際等級(jí)相一致，且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)各等級(jí)間的差異量化，表明可以將所建立的指紋圖譜相似度計(jì)算方法應(yīng)用于同品種不同等級(jí)綠茶的分等定級(jí)中。

對(duì)未知樣品的分級(jí)要通過(guò)先建立其HPLC指紋圖譜，采用上述方法，尤其是新改良程度相似度計(jì)算方法，與信陽(yáng)毛尖茶標(biāo)準(zhǔn)樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度對(duì)比，確定未知茶樣的等級(jí)。該結(jié)果可為茶葉分等定級(jí)提供理論研究支持和方向。