IL-6啟動子-572C/G和-597G/A基因多態性與2型糖尿病下肢血管病變的關系

王艾云

天津市北辰區中醫醫院 300400

下肢血管病變(Vascular disease of lower extremity，VDLE)是T2DM患者較為常見的一種合并癥，往往會引起肢端壞疽癥狀的發生，對患者的生活質量產生較大的影響。目前，臨床上關于T2DM合并VDLE的發病機制尚未完全明晰。相關文獻報道稱[1]：該病可能是與機體免疫功能異常存在一定的關聯性，屬于一種因自身免疫系統紊亂而導致的一種炎性反應。當血管內皮細胞受到損傷時，機體相關炎性因子如IL-6的表達水平以及活性顯著增高。IL-6是介導免疫反應以及炎性反應的一種十分重要的遞質，可引起多種細胞發生增殖反應。而遺傳因子如啟動子基因的多態性能夠顯著提高IL-6的表達水平以及活性，可能是T2DM合并VDLE發病的一個十分重要的影響因素[2]。本研究主要探討了IL-6啟動子-572C/G和-597G/A基因多態性與T2DM合并VDLE發病之間的相關關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月—2018年8月于我院接受診療的190例T2DM患者作為觀察對象，均為漢族患者，且相互之間無親緣或者血緣關系。男女比例為90∶100；年齡為43～69歲，平均年齡(57.29±6.56)歲；BMI范圍為20～28，平均BMI 24.38±2.12。VDLE診斷標準為：經血管彩色多普勒超聲診斷，動脈內膜厚度增加在1mm以上，血管管壁欠光滑或者粗糙，存在血管管腔狹窄或者閉塞。將本組入選對象分為合并VDLE組(n=99)與未合并VDLE組(n=91)。另外選擇同期于我院參加體檢的85名健康者作為對照組。上述3組入選對象在性別及年齡方面的差異均無統計學意義。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取方法:上述3組入選對象均于晨起空腹狀態下抽取肘靜脈血3.0ml，采用EDTA進行抗凝，于-80℃的冰箱中進行保存，將外周血基因組DNA進行提取，采用分光光度儀對光度值進行測定，據此對DNA純度以及濃度水平進行計算。

1.2.2 基因分析方法:將限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應方法(Restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction，PCR-RFLP)對IL-6啟動子區-572C/G與-597G/A基因多態性進行測定分析。引物序列見表1。

表1IL-6啟動子區-572C/G與-597G/A基因多態性引物序列

PCR反應體系：采用體積為2.5μl的10×PCR緩沖液，4.0μl的濃度為10mmol/L的dNTP，取上、下游引物各為1.0μl，1.0μl的模板DNA，0.2μl的濃度為5U/μl的Taq DNA酶，然后加水至25μl。具體條件為：94℃溫度條件下預變性時間為5min，變性時間為40s，58℃退火時間為1min，35次循環之后72℃條件下延伸5min。PCR產物采用質量水平為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定之后，采取限制性內切酶BsrB I于37℃條件下消化約120min，再使用濃度為2%的TBE瓊脂糖進行電泳試驗(見圖1、2)，采用紫外凝膠成像分析儀對上述PCR結果進行仔細觀察。

圖1IL-6啟動子-572C/G的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果示意圖

注：1、2、3、4道分別代表DL2000 DNA標記物、基因型C/C、G/C以及G/G。

1.3 觀察指標 比較合并VDLE組、未合并VDLE組以及對照組IL-6啟動子-572C/G與-597G/A的基因型及等位基因頻率分布情況；IL-6啟動子-572C/G與-597G/A基因電泳試驗結果。

圖2IL-6啟動子-597G/A的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果示意圖

注：1、2、3、4道分別代表DL2000 DNA標記物、基因型G/G、G/A以及A/A。

2 結果

2.1 3組入選對象IL-6啟動子-572C/G的基因型及等位基因頻率分布情況對比 合并VDLE組CG、GG、G頻率均顯著高于未合并VDLE組與對照組(P均<0.05)，見表2。

表23組入選對象IL-6啟動子-572C/G的基因型及等位基因頻率分布情況比較[n(%)]

注：aP<0.05，VS對照組；bP<0.05，VS未合并VDLE組。

2.2 3組入選對象IL-6啟動子-597G/A的基因型及等位基因頻率分布情況對比 合并VDLE組GA、AA、A頻率均顯著低于未合并VDLE組與對照組(P均<0.05)，見表3。

表33組入選對象IL-6啟動子-597G/A的基因型及等位基因頻率分布情況比較[n(%)]

注：aP<0.05，VS對照組；bP<0.05，VS未合并VDLE組。

3 討論

相關文獻報道稱：自身免疫性炎癥與T2DM大血管病變存在密切的關聯性，也有學者認為[3]：糖尿病及其大血管合并癥是自身免疫所介導的炎性疾病。某些重要的炎性因子及其免疫標志物，如IL-6等因子均可能與糖尿病大血管合并癥存在緊密的關聯性。IL-6屬于一種功能多元化的細胞因子，其在免疫系統、造血系統及神經系統之中均存在著十分重要作用，該指標水平上升也是導致糖尿病發病的一個高危因素。當前，臨床上關于IL-6與糖尿病大血管病變的研究主要集中于心腦血管病變方面，而IL-6與T2DM合并VDLE之間的相關關系方面的研究則非常少。相關文獻資料報道稱[4-5]：IL-6啟動子-572C/G與-597G/A基因多態性與動脈阻塞性肺疾病呈現出明顯關聯性。雖然T2DM合并VDLE的發病機理與粥樣硬化性病變比較接近，然而其機制更加復雜。因此，探討IL-6啟動子-572C/G與-597G/A基因多態性與T2DM合并VDLE之間相關關系，具有較高臨床價值。

本文結果顯示：合并VDLE組CG、GG、G頻率均顯著高于未合并VDLE組與對照組(P均<0.05)，合并VDLE組GA、AA、A頻率均顯著低于未合并VDLE組與對照組(P均<0.05)。出現上述結果，主要原因在于：IL-6作為一個常見的炎性因子，它在基因水平的單核苷酸多態性與T2DM合并VDLE提供全新的治療對策。上述結果提示：基于傳統治療，還應該開展相應的抗炎以及抗免疫治療。隨著臨床上對糖尿病地不斷深化認識，筆者發現血糖水平控制理想并不能減少或延緩合并癥的出現，特別是大血管合并癥。而越來越多的證據顯示：自身免疫功能紊亂以及長期的慢性炎癥在糖尿病及其合并癥的進展過程中扮演著非常重要的角色。從免疫學的角度來探討糖尿病及其并發癥的發病機制，是今后研究的一個重點方向和焦點。

綜上所述，IL-6啟動子-572C/G和-597G/A基因多態性與T2DM合并VDLE發病之間存在緊密的相關性，可能參與T2DM及其并發癥的發生發展過程。