法舒地爾與骨髓間充質干細胞共育液對大鼠脊髓損傷后氧化應激和炎癥反應的影響

詹吉恒 肖方駿 羅丹 侯宇， 林定坤

1廣州中醫藥大學第二臨床醫學院（廣州510405）；2廣州中醫藥大學第二附屬醫院骨一科（廣州510120）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱專科的危重癥之一，具有較高的致殘率。其病理機制以繼發性損傷中的神經元凋亡以及炎性反應、氧化應激損傷等為主［1］，而SCI 后積極的抗炎、抗氧化治療，不僅能保護殘存的神經元細胞，還能促進肢體功能的恢復［2］。既往研究多采用單種藥物進行干預，但其收效甚微［3-4］，因此尋找一種新的治療方式以糾正SCI 后機體的炎癥和氧化應激水平是目前治療的關鍵。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有高效的自我更新和增殖能力，同時能分泌細胞因子以調控內環境，故常被用作移植細胞治療SCI［5］。但大量的研究發現移植細胞雖成功到達目標區域，脊髓傷區卻未得到有效修復，多數學者推測可能是受傷區局部氧化應激、炎癥反應的影響。法舒地爾（fasudil，FAS）不僅是臨床常用的血管擴張藥物，還對多種臟器具有保護作用，該現象與其緩解氧化應激并降低炎癥反應的活性產物釋放密切相關［6］。因此筆者推測使用FAS 處理BMSCs 可能提高后者在SCI 大鼠體內的活性，并調節機體氧化應激水平和炎癥反應。為此，本課題組通過體外研究FAS 對BMSCs 活性的影響，并建立動物模型，以觀察FAS 與BMSCs 共育液對SCI 大鼠的治療作用及可能的機制，為后期運用干細胞移植治療SCI提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級3 周齡雌性SD 大鼠4 只，用于提取BMSCs；SPF 級3月齡雌性SD 大鼠40 只，用于建立脊髓損傷動物模型。動物均由廣東省醫學實驗動物中心提供，飼養于廣州中醫藥大學第一附屬醫院SPF 動物實驗室，自由攝水飲食。

1.2 實驗試劑與儀器α-MEM 培養基、胎牛血清（Gibco 公司），大鼠間充質干細胞檢測試劑盒（Cyagen 公司），虎杖苷（Sigma 公司），CCK-8 試劑盒（碧云天公司），iNOS 多克隆抗體、GADPH 抗體（Abcam 公司），NF-κB 多克隆抗體（NOVUS 公司），IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒（酶聯生物公司），SOD、MDA 試劑盒（南京建成公司），CO2細胞培養箱（Thermo 公司），倒置相差顯微鏡（Leica 公司），電泳儀、凝膠成像系統（Bio-Rad 公司），PCI-3000 精密大小鼠脊髓損傷撞擊器（Hatteras Instruments 公司）。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs 的培養與鑒定取3 周齡SD 大鼠，以全骨髓貼壁法提取原代骨髓間充質干細胞，當貼壁細胞融合度達90%即可按1∶3 比例傳代。取第3 代細胞，消化后制成單細胞懸液，分別取3×105個細胞進行CD44-PE、CD34-PE 染色，并設立同型陰性對照，PBS 清洗后4 ℃避光孵育二抗30 min，細胞重懸后用流式細胞儀進行細胞表型鑒定。

1.3.2 CCK-8 細胞活性檢測取第3 代細胞，按1×104/孔接種于96 孔板，置于CO2培養箱中培養。細胞貼壁后，加入不同濃度FAS（3、10、30、100 μmol/L）干預24 h，各有5 個復孔。干預結束后于每孔加入10 μL CCK-8 溶液，于培養箱中繼續孵育2 h 后，在酶標儀波長450 nm 處檢測吸光值，并計算各組細胞活性。

1.3.3 動物分組及脊髓損傷模型建立3月齡SD大鼠隨機分為4 組：假手術組、模型組、BMSCs 組、BMSCs+FAS 組，每組10 只。麻醉成功后，逐層暴露，咬除T8-T10 椎板，顯露脊髓。參照改良Allen′s法，以10.0 g、0.8 mm/s 的致傷速率打擊T9節段脊髓，以大鼠身體發生一過性顫抖、雙下肢迅速回縮并揮動、尾巴來回擺動為模型制備成功的標志。術后連續3 d 肌注青霉素預防感染，每日2 次按摩膀胱進行人工排尿，直至大鼠恢復自主排尿功能。

1.3.4 給藥方法于術后第1、3、5天通過尾靜脈注射對各組大鼠進行干預。BMSCs 組：細胞消化后離心，重懸吹打成細胞懸液，調整密度為1×106/mL，取1 mL 用于尾靜脈移植；BMSCs+FAS 組：按照前期研究結果，移植30 μmol/L FAS 與BMSCs 共育液，細胞密度同BMSCs 組。假手術組和模型組注射等體積生理鹽水。

1.3.5 抗氧化酶系統活性測定術后1 周取傷區脊髓組織，勻漿后離心并取上清，稀釋至1%濃度，以化學比色法測定脊髓組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平，具體步驟按南京建成公司提供的檢測試劑盒說明進行操作。

1.3.6 炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α測定脊髓組織中白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量使用ELISA 法檢測。將脊髓組織勻漿，提取蛋白后進行濃度測定。上樣后于37 ℃孵育30 min，洗滌后加入酶標試劑繼續作用30 min，最后加入顯影劑并檢測吸光值，按照ELISA 試劑盒說明書計算各炎癥因子表達量。

1.3.7 Western blot 檢測脊髓組織iNOS、NF-κB蛋白表達裂解脊髓組織，提取總蛋白，BCA 法定量后使蛋白變性。于10% SDS 電泳中分離并轉膜至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min，4 ℃孵 育 一 抗iNOS（1∶1000）、NF-κB（1∶1 000）和GADPH（1∶2 000）過夜，TBST 洗膜后再加入對應HRP 標記二抗室溫孵育90 min，ECL 顯影。以GADPH 為內參，用ImageJ 軟件計算目的條帶灰度值。

1.3.8 下肢運動功能評分將大鼠在術后第1、7、14、21、30 天置于曠場中自由活動5 min，根據Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分評價各組大鼠后肢運動能力。最大值為21 分，0 分表示完全癱瘓，21 分表示正常。每只大鼠均評定3 次，取其平均值。

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，實驗數據以± s 表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs 的形態提取的大鼠BMSCs 以靜態貼壁形式生長，經過傳代培養可純化，呈形態規則、大小均一的梭形，第3 代細胞培養3～4 d 可達80%融合度（圖1A）。

2.2 BMSCs 的流式細胞術鑒定流式細胞儀檢測結果顯示，CD44 表達陽性（95.1%），CD34 表達陰性（0.8%），證實所培養細胞為大鼠BMSCs（圖1B～D）。

2.3 FAS 對BMSCs 活性的影響如圖2 所示，與對照組相比，FAS 在3 μmol/L 濃度時對BMSCs 的活性沒有顯著影響（P ＞0.05），10、30 μmol/L 的FAS 可提高BMSCs 的活性，其中30 μmol/L 時細胞活性最佳（P ＜0.05），而100 μmol/L FAS 對BMSCs活性有一定抑制作用，故選用30 μmol/L FAS 用于后續實驗。

圖2 FAS 干預對BMSCs 細胞活性的影響Fig.2 Effects of FAS on the viability of BMSCs

2.4 BBB 評分術后BBB 評分結果顯示，除假手術組外，其余組別大鼠均明顯降低，但3 組間BBB評分差異無統計學意義（P ＞0.05）。與模型組比較，在術后第14、21 和30 天，BMSCs 組及BMSCs +FAS 組大鼠BBB 評分均出現不同程度改善（P ＜0.05）。術后30 d，BMSCs+FAS 組大鼠BBB 評分改善幅度優于BMSCs 組（P ＜0.05，表1）。

2.5 FAS 對SCI 大鼠脊髓組織中氧自由基的影響大鼠造模后，脊髓組織SOD 活力下降，MDA含量增加，iNOS 蛋白表達上升（P ＜0.05）。經干預后，BMSCs 組與BMSCs+FAS 組脊髓組織的SOD活力明顯高于模型組（P ＜0.05），而MDA 含量及iNOS 蛋白表達則低于模型組（P ＜0.05），其中BMSCs+FAS 組iNOS 蛋白表達較BMSCs 組更低（P ＜0.05）（圖3、圖4A ～B）。

圖3 各組脊髓組織中SOD 活力及MDA 水平Fig.3 SOD activity and MDA content in spinal cord tissues of each group

2.6 FAS 對SCI 大鼠脊髓中炎癥因子含量的影響造模后，SCI 大鼠脊髓中炎癥因子含量均顯著升高（P ＜0.05）。與模型組比較，BMSCs 組和BMSCs+FAS 組經干預后脊髓中IL-1β、IL-6、TNF-α及NF-κB含量均減少（P ＜0.05）。其中BMSCs+FAS 組大鼠脊髓中NF-κB 蛋白表達比BMSCs 組更低（P ＜0.05），但兩組間炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量差異無統計學意義（圖4A～C、圖5）。

表1 各組大鼠術后不同時間點BBB 評分Tab.1 BBB scores of each group at different time points after surgery ±s

表1 各組大鼠術后不同時間點BBB 評分Tab.1 BBB scores of each group at different time points after surgery ±s

注：與模型組相比，*P ＜0.05；與BMSCs 組相比，△P ＜0.05

組別假手術組模型組BMSCs組BMSCs+FAS組術后1 d 21.0±0.00 1.2±0.84 1.4±0.55 1.3±0.45術后7 d 21.0±0.00 3.4±1.34 4.4±1.52 4.6±0.89術后14 d 21.0±0.00 4.6±1.14 7.6±1.14*7.8±1.30*術后21 d 21.0±0.00 5.6±0.89 8.4±0.55*9.4±1.82*術后30 d 21.0±0.00 6.6±1.52 9.6±0.89*11.4±1.52*△

圖4 Western blot 法檢測脊髓組織中iNOS、NF-κB 的蛋白表達Fig.4 The expression of iNOS,NF-κB protein detected by Western blot

圖5 ELISA 檢測各組脊髓組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量Fig.5 ELISA results for IL-1β，IL-6，and TNF-α in spinal cord tissues of each group

3 討論

3.1 氧化應激與炎癥反應在SCI 病理過程中的影響SCI 后氧自由基和炎癥因子水平有明顯的上調趨勢，表明繼發性損傷的發生。SCI 的已知效應之一是鈣離子活化和活性氧的產生及其下游效應，導致細胞等大分子的氧化損傷，SOD 活力降低，體內氧自由基等產物堆積，氧化還原水平失衡，伴隨之iNOS 表達上升［7］。其中脂質過氧化和蛋白質氧化損傷是SCI 氧化應激的重要因素，當脂質中多不飽和脂肪酸被活性氧簇攻擊時即生成脂質過氧化產物MDA，而MDA 又能加劇神經元胞膜的損傷［8］。因此可以通過了解SOD 活力、MDA 含量及iNOS 表達評估氧化應激程度［9］。炎癥反應作為繼發性損傷的主要介質，在SCI 的發病過程中起著重要的調節作用。中樞神經系統和血液中的固有免疫細胞會引發炎癥反應，隨著病情發展，上述級聯事件持續惡化并導致慢性炎癥，引起細胞凋亡、壞死以及自噬［10］。據報道，與SCI有關的炎癥相關因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α及其介質NF-κB，均被認為是導致神經損傷的重要因素［11］。由于以氧化應激和炎癥反應為主的繼發性損傷會造成疾病進一步惡化，因此在該節點上進行有效干預作為一種保護策略具有重大意義。

3.2 FAS與BMSCs共育液治療SCI外源性BMSCs移植治療SCI 由來已久，BMSCs 通過遷移，到達并整合至脊髓傷區中，借由旁分泌機制合成并分泌一系列生物活性物質，對微環境具有積極的調控作用［12］。王亮等［13］用該方法治療SCI 大鼠模型，結果顯示，BMSCs 組大鼠的脊髓組織勻漿中NF-κB、p65、IL-1β和TNF-α的水平明顯低于模型組，并認為這可能是通過抑制TLR4 介導的信號傳導來減少脊髓組織中炎癥反應。卜志勇等［14］在類似的研究中也發現移植BMSCs 能有效調控抗氧化酶系統活性。本研究結果表明，SCI 大鼠急性期脊髓組織SOD 活性降低，而MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及iNOS、NF-κB 的蛋白表達均增加，上述指標在兩個治療組中均有所改善，其中BMSCs+FAS組改善幅度最明顯，并表現出更好的后肢運動功能。表明FAS 與BMSCs 共育液可有效減輕SCI 大鼠的氧化應激和炎癥反應，并發揮治療作用。

3.3 FAS 與BMSCs 的關系徐小隔等［15］采用FAS 干預大鼠BMSCs，發現BMSCs 胞體收縮成球形，并伸出較多細長突起，且隨時間正向上調NSE和MAP-2 基因表達。筆者前期研究也發現，經FAS 預處理后的BMSCs 能更多地經由尾靜脈遷移至脊髓傷區，且該促遷移現象能維持3 周以上［16］。本實驗研究還發現，FAS 在30 μmol/L 時細胞活性最佳，而100 μmol/L 的FAS 對BMSCs 活性有一定抑制作用。此外，FAS 還能活化Nrf2 及其下游的基因，而該現象被證實與抗氧化活性及抗炎能力成正相關［17］。上述研究結果表明FAS 對大鼠BMSCs具有促神經元樣細胞分化、促遷移及提高其活性的作用，共同為FAS 聯合BMSCs 移植治療SCI 提供了有力的理論支持。

綜上所述，FAS 與BMSCs 共育液移植治療對SCI 大鼠急性期具有積極的保護作用，并有利于后期肢體運動功能恢復，這種作用可能是基于其降低脊髓傷區活性氧簇水平，提高機體抗氧化酶系統的活性，并減少炎癥因子的釋放。本研究為SCI的臨床藥物靶點治療提供了重要線索，也為FAS的開發運用提供了方向，但內在的分子作用機制及調控通路仍有待進一步研究以明確。