丙泊酚預(yù)處理對大鼠肝移植術(shù)后急性腎損傷的影響

孟凡兵 劉悅 沈?qū)?羅剛健

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉手術(shù)中心（廣州510630）

肝移植是目前治療終末期肝病最為有效的手段，隨著肝移植技術(shù)的提高和手術(shù)方式的成熟，各種術(shù)后并發(fā)癥的防治已經(jīng)成為肝移植研究領(lǐng)域關(guān)注的主要問題［1］。在眾多器官并發(fā)癥中，急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是肝移植圍術(shù)期最為常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥［2］。肝移植過程中門脈阻斷導(dǎo)致的低血壓引起腎低灌注，門脈和腔靜脈開發(fā)又引起腎血流再灌注，缺血再灌注這一過程在肝移植術(shù)后AKI 的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用［3］。研究［4］表明，丙泊酚對缺血再灌注引起的損傷有保護(hù)作用。同時(shí)，筆者的前期研究表明，細(xì)胞凋亡在小鼠腎缺血再灌注損傷中有重要的作用［5］，而且，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）在腎臟組織的高表達(dá)有利于抑制細(xì)胞凋亡［6］。而在肝移植引起的術(shù)后AKI 中是否有細(xì)胞凋亡的參與尚不十分清楚。本研究在大鼠自體原位肝移植（AOLT）模型上探究丙泊酚預(yù)處理對肝移植術(shù)后AKI 的影響及其可能涉及的機(jī)制，旨在為肝移植術(shù)后并發(fā)癥的防治提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組8 周齡的SD 大鼠40 只，體質(zhì)量（220 ± 20）g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將40 只大鼠隨機(jī)分為4 組：假手術(shù)組、肝移植模型組、脂肪乳干預(yù)組（構(gòu)建肝移植模型前給予脂肪乳預(yù)處理）、丙泊酚干預(yù)組（構(gòu)建肝移植模型前給予丙泊酚預(yù)處理），每組10 只。對肝移植模型組大鼠進(jìn)行AOLT 模型的構(gòu)建，假手術(shù)組只開腹和游離相應(yīng)血管，對脂肪乳干預(yù)組和丙泊酚干預(yù)組大鼠建模前連續(xù)3 d 每天分別腹腔注射50 mg/kg 脂肪乳和丙泊酚，直至建模當(dāng)天［7］。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器主要試劑：血尿素氮（BUN）與血肌酐（Scr）檢測試劑盒（美國Beckman 公司）、dUTP 缺口末端標(biāo)記（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美國Roche Applied Science 公司）、蛋白提取試劑盒（南京KeyGEN BioTECH 公司）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（賽默飛世爾科技公司）、SIRT1 抗體（美國CST 公司）、caspase3 抗體（美國CST 公司）、actin 抗體（美國CST 公司），anti-rabbit-HRP（美國CST 公司）、ECL 發(fā)光液（美國Tanon 公司）。主要儀器：CX4型全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckman公司）、多功能酶標(biāo)儀ELx800NB（美國Bio-TEK 公司）。

1.3 動(dòng)物模型建立復(fù)制大鼠AOLT 模型［7-8］：大鼠術(shù)前常規(guī)禁食8 h；使用自制麻醉盒行七氟醚半開放吸入麻醉。手術(shù)體位取仰臥位，腹部備皮、消毒后腹部正中切口，暴露腹腔。模型組打開腹腔后先剪斷左三角韌帶及肝圓韌帶，分離并結(jié)扎左膈靜脈；然后，打開右側(cè)后腹膜，分離出肝上下腔靜脈；游離、結(jié)扎右腎上腺靜脈；游離肝下下腔靜脈并過線，向上翻轉(zhuǎn)肝臟，暴露第一肝門，游離門靜脈至肝門部，過線，并一同游離鄰近的肝動(dòng)脈和膽管。使用肝素鹽水（25 U/mL）1 mL 行全身肝素化，然后在腸系膜上靜脈、肝動(dòng)脈及脾靜脈血管匯合處上微血管夾阻斷門靜脈，用4 號針頭刺入門靜脈，推少量肝素鹽水，使肝內(nèi)血液進(jìn)入到體循環(huán)中。用微血管夾阻斷門靜脈、肝上下腔靜脈和肝下下腔靜脈，經(jīng)門靜脈緩慢持續(xù)灌注含肝素的醋酸林格液（12.5 U/mL）共30 mL，在肝下下腔靜脈壁剪開約1 mm 作為灌注液流出道，當(dāng)肝臟顏色變?yōu)橥咙S色表示灌注成功，持續(xù)灌注約20 min，手術(shù)過程中注意加溫以維持大鼠體溫。灌注完成后拔出針頭，縫合穿刺點(diǎn)和流出道，然后，松開微血管夾恢復(fù)血流灌注，最后關(guān)腹。假手術(shù)組在麻醉后按相同步驟進(jìn)行開腹和游離血管，但不進(jìn)行肝臟的阻斷和再灌注。模型組在肝臟恢復(fù)灌注后8h 在深度麻醉下處死大鼠取材。

1.4 腎組織病理學(xué)檢查取大鼠相同部位腎組織立即于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋、切片，用蘇木素-伊紅（HE）對切片進(jìn)行染色。在400 倍光學(xué)顯微鏡下，等間距隨機(jī)選取10 個(gè)視野進(jìn)行拍攝。

1.5 腎功能指標(biāo)的檢測于大鼠腹主動(dòng)脈取血5 mL，將血液標(biāo)本注入含有促凝劑和分離膠的試管中，37 ℃、3 000 r/min 離心15 min，取上清液，采用全自動(dòng)生化分析儀測定Scr、BUN 水平。

1.6 腎組織細(xì)胞凋亡的檢測石蠟切片脫蠟、滴加蛋白K 工作液（15 μg/mL）孵育30 min，加50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液，37 ℃避光孵育1 h。用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，加DAPI 孵育3 min，于400倍熒光顯微鏡下觀察腎組織細(xì)胞凋亡情況并等間距隨機(jī)選取10 個(gè)視野進(jìn)行拍攝。

1.7 腎組織SIRT1 和caspase3 蛋白表達(dá)量的檢測用蛋白提取試劑盒提取大鼠腎組織蛋白，BCA 法定量，SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)，100 V，100 min），5% 脫脂牛奶室溫封閉1.5 h；加入一抗（anti-SIRT1 1∶1 000、anti-caspase3 1∶1 000、anti-actin 1∶2 000）4 ℃孵育過夜；PBST 洗滌3 次，每次5 min；加入二抗（anti-rabbit 1∶5 000）室溫孵育1.5 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min；置于ECL 中1 min，使用膠片曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織病理學(xué)變化術(shù)后8 h 假手術(shù)組大鼠腎組織未見明顯的病理改變；肝移植模型組大鼠腎組織出現(xiàn)嚴(yán)重的病理損傷；與AOLT 模型組相比，脂肪乳干預(yù)組大鼠腎組織病理損傷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而丙泊酚干預(yù)組大鼠腎組織病理損傷顯著減少（圖1）。

2.2 腎功能變化與假手術(shù)組相比，模型組大鼠術(shù)后8 h 血BUN 和Cr 的水平顯著升高；與模型組相比，脂肪乳干預(yù)組大鼠血BUN 和Cr 的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而丙泊酚干預(yù)組大鼠血BUN 和Cr的水平顯著降低（P ＜0.05，圖2）。

圖1 腎組織HE 染色（×400）Fig.1 Kidney tissue HE staining

圖2 BUN 和Cr 水平的變化Fig.2 Changes of BUN and Cr level

2.3 腎組織凋亡情況與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡顯著升高（P ＜0.05，圖3、4）；與模型組相比，脂肪乳干預(yù)組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而丙泊酚干預(yù)組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡顯著降低（P ＜0.05，圖3、4）。

2.4 腎組織SIRT1 和凋亡相關(guān)蛋白caspase3 表達(dá)量的變化與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎組織caspase3的表達(dá)量顯著升高；與模型組相比，脂肪乳干預(yù)組大鼠腎組織caspase3的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而丙泊酚干預(yù)組大鼠腎組caspase3 的表達(dá)顯著降低（P ＜0.05，圖5）。而腎組織SIRT1的表達(dá)量在模型組顯著升高，脂肪乳對SIRT1 的表達(dá)無顯著影響，丙泊酚可進(jìn)一步上調(diào)SIRT1在腎臟組織的表達(dá)。

圖3 腎組織凋亡染色圖片（TUNEL，×400）Fig.3 Apoptotic staining images of renal tissue

圖4 腎組織細(xì)胞凋亡率的變化Fig.4 Changes of cell apoptotic rate of kidney tissue

圖5 SIRT1 和caspase3 蛋白表達(dá)的變化Fig.5 Changes of protein expression of SIRT1 and caspase3

3 討論

AKI 是肝移植術(shù)后最為常見和嚴(yán)重的并發(fā)癥，對患者的生命安全和預(yù)后造成巨大的威脅［2］。肝移植手術(shù)過程中缺血再灌注這一過程可能對急性腎損傷的發(fā)生和發(fā)展有重要的作用［3］。大量的研究結(jié)果表明，丙泊酚作為最為常用和有效的靜脈麻醉藥，對缺血再灌注引起的損傷具有保護(hù)作用［9-10］。而SIRT1 作為一種去乙酰化酶，可以降低p53 和Foxo3的乙酰化水平，抑制它們的促凋亡作用［11-12］。

本研究通過建立大鼠原位肝移植模型并用丙泊酚預(yù)處理來探究其在肝移植術(shù)后AKI 中的作用及其可能涉及的機(jī)制。丙泊酚預(yù)處理能減輕肝移植術(shù)后大鼠腎臟組織病理損傷和腎功能損傷［5］，但細(xì)胞凋亡在其中的作用尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷了肝移植的打擊后，大鼠腎組織SIRT1 和凋亡相關(guān)蛋白caspase3 表達(dá)量升高，給予丙泊酚預(yù)處理的大鼠在經(jīng)歷肝移植打擊后SIRT1 表達(dá)量升高的更加顯著，而caspase3 表達(dá)量有所降低。有研究表明，腎臟在經(jīng)歷缺血再灌注后，SIRT1 會(huì)呈現(xiàn)出誘導(dǎo)性表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮保護(hù)作用，以抵御這一病理生理過程給機(jī)體帶來的損傷［12］。這提示丙泊酚可能通過進(jìn)一步上調(diào)SIRT1 的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕腎組織的損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡在肝移植術(shù)后急性腎損傷中起重要作用，而丙泊酚預(yù)處理能進(jìn)一步上調(diào)腎組織SIRT1 的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕肝移植術(shù)后大鼠的急性腎損傷。這一發(fā)現(xiàn)提示，可以通過抑制細(xì)胞凋亡來防治肝移植術(shù)后急性腎損傷。然而，本研究只是初步探討了肝移植術(shù)后AKI 的分子機(jī)制，具體的更深入的機(jī)制研究還有待進(jìn)一步完善。為了進(jìn)一步證實(shí)SIRT1 在丙泊酚預(yù)處理中的作用，后續(xù)研究可以使用SIRT1 的抑制劑或利用基因敲除來加以驗(yàn)證。