XPNPEP2 在胃癌組織中的表達及其臨床意義

王偉 周穎 蔣桂英 魏睿 陳曦 奚玲 李飛

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院腫瘤生物醫學中心（武漢430030）

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。盡管近年來在手術和其他治療方面取得了顯著的成就，但胃癌患者的5年生存率仍然很低［1］。因此，進一步研究胃癌的分子機制從而為胃癌提供更加合理的治療方案十分緊迫。XPNPEP2（aminopeptidase P2，氨基肽酶P2 或APP2）是由位于Xq 25 染色體上的人XPNPEP2 基因編碼［3］的一種膜結合金屬蛋白酶，可催化去除氨基酸序列中脯氨酸N 端P1 位點的氨基酸殘基［2］。膠原蛋白、激素、生長因子和細胞因子等生物活性肽的N 末端都含有xaa-Pro 序 列，因 此 是XPNPEP2 的 潛 在 底 物［3］。XPNPEP2 參與調節血管擴張劑緩激肽的代謝，目前其研究主要集中在心血管疾病方面，研究發現XPNPEP2 可能影響ACEI 藥物引起的血管性水腫副作用的發生率［4］。且XPNPEP2 基因是女性卵巢早衰的標記基因之一［5］，近年來亦有報道XPNPEP2 可影響卵泡的發育成熟［6］。本課題組在前期研究中發現XPNPEP2 為惡性腫瘤轉移的分子標志，在宮頸癌中高表達并可促進宮頸癌轉移［7］。筆者在Kaplan-Meier Plotter 在線數據庫中亦發現胃癌患者中XPNPEP2 mRNA 高表達可能預示著較低存活率。因此思考XPNPEP2 的改變是否可提示胃癌的發生與發展，然而，尚未有學者就XPNPEP2 在胃癌中的表達及作用進行報道。故本研究基于組織芯片技術，運用免疫組織化學方法檢測XPNPEP2 蛋白在72 例胃癌組織及與之部分配對的60 例癌旁組織中的表達情況，并分析其與胃癌臨床病理參數及預后的相關性，希望能為胃癌的診斷及預后提供新的分子標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料附有相關臨床病理信息及術后隨訪資料的孔徑1.5 mm的胃癌組織芯片1張。組織芯片標本來源于華中科技大學附屬同濟醫院2006年7月至2007年4月期間行胃癌根治術的患者72 例。標本均經病理確診為胃癌，其臨床分期根據美國癌癥分期委員會制定的胃癌TNM 分期標準，取60 例癌旁組織。72 例胃癌患者中有40 例患者脈管浸潤病理診斷不明確，故未納入統計。標本經4%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋。本次標本使用經倫理委員會批準。本組病例性別、年齡、腫瘤大小、脈管浸潤、臨床分期等見表1。

表1 XPNPEP2 在胃癌中的表達與臨床病理參數之間的關系Tab.1 The relationship between expression of XPNPEP2 and clinicopathological parameters in gastric carcinoma

1.2 主要試劑兔抗人XPNPEP2 多克隆抗體（GTX109995，1∶200），SP 染色試劑盒、DAB 顯色試劑盒、蘇木素染色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化將組織芯片蠟塊以4 μm 連續切片，篩選完整樣本切片先做HE 染色，再嚴格按照免疫組化SP 法試劑盒說明進行操作。切片置于恒溫箱中烘烤脫蠟；再置于二甲苯中脫蠟2 次；酒精梯度脫水；抗原修復；阻斷過氧化物酶；山羊血清室溫封閉；封一抗、封HRP 標記二抗，DAB 顯色；蘇木精復染；自來水分化；中性樹脂封片，顯微鏡觀察。以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷采用雙盲法由2 名病理科醫生對免疫組化結果閱片并評分。XPNPEP2 陽性結果為細胞出現棕黃色至深褐色。參照文獻［8］按陽性著色強度和陽性細胞百分比進行評分，陽性著色強度：0分（陰性），1分（弱陽性，淺黃色），2分（中等陽性，棕黃色），3 分（強陽性，褐色）。陽性細胞百分比：0 分（0%），1 分（1%～25%），2 分（26%～50%），3 分（51%～75%），4分（76%～100%）。免疫染色總分=陽性著色強度×陽性細胞百分比評分。總分范圍0 ～12分，0 ～4分為低表達，5 ～12分為高表達。

1.5 隨訪采取電話隨訪、患者所在地公安局人口處查詢等方式隨訪，隨訪截止時間2014年9月，隨訪時間1 ～90 個月，中位隨訪時間48 個月。

1.6 統計學方法運用SPSS 17.0 軟件進行數據統計分析。計數資料以率（%）表示，組間陽性率比較采用卡方檢驗，使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank 檢驗，預后評估運用Cox 比例風險模型。以P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 XPNPEP2 在胃癌組織及癌旁組織中的表達如圖1 所示，XPNPEP2 蛋白陽性表現為細胞內出現棕黃色顆粒。XPNPEP2 蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的高表達率分別為61.11%、43.33%，差異具有統計學意義（χ2=4.153，P=0.042）。

2.2 XPNPEP2 蛋白的表達與胃癌臨床病理特征之間的關系XPNPEP2 在胃癌組織中的表達情況與臨床各病理參數如年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤浸潤程度、脈管浸潤和TNM 分期均未見明顯統計學相關性（P ＞0.05），見表1。

2.3 XPNPEP2 蛋白表達情況與胃癌患者總生存期及預后的關系72 例胃癌患者中，XPNPEP2 高表達患者44 例，生存率為20.5%；XPNPEP2 低表達患者28 例，生存率為42.9%。高表達組患者平均生存時間為35.3 個月，95%CI：25.77 ～44.91；低表達組患者平均生存時間為55.0 個月，95%CI：42.48 ～67.52（圖2），XPNPEP2 蛋白高表達患者與低表達患者總生存率差異具有統計學意義（χ2= 5.44，P = 0.02）。且在Kaplan-Meier Plotter 數據庫中876 例胃癌患者的資料亦發現XPNPEP2 高表達者的總生存期明顯短于低表達者（P ＜0.01），見圖3。

圖1 XPNPEP 在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達（免疫組織化學染色×200，×400）Fig.1 Expression of XPNPEP in gastric carcinoma and adjacent normal tissues

圖2 XPNPEP2 高低表達組總生存期比較Fig.2 Comparison of over all survival between high and low XPNPEP2 expression levels

圖3 Kaplan-Meier Plotter 數據庫中XPNPEP2 mRNA 表達水平對胃癌預后的影響Fig.3 The prognostic of the XPNPEP2 mRNA level in gastric cancer was got from Kaplan-Meier Plotter

單因素COX 分析顯示：胃癌患者的預后與XPNPEP2 表達水平（χ2= 5.09，P = 0.024）、脈管浸潤（χ2= 19.25，P ＜0.001）、TMN 分期（χ2= 7.39，P = 0.007）緊密相關，XPNPEP2 高表達、脈管發生浸潤、TMN 分期Ⅲ+Ⅳ期患者預后明顯更差（表2）；將單因素分析中差異具有統計學意義的指標納入多因素Cox 分析示，脈管浸潤是影響胃癌預后的獨立因素（χ2=16.69，P ＜0.001）（表3）。

表2 單因素COX 生存分析Tab.2 Univariate cox survival analysis

表3 多因素COX 生存分析Tab.3 Multivariate cox survival analysis

3 討論

中國胃癌發病例數和死亡例數分別占全球胃癌發病和死亡的42.6%和45.0%，在全球183 個國家中發病率位于第5 位，病死率位于第6 位［9］。然而胃癌的發病原因尚未完全明了。

前期研究發現氨基肽酶M 與皮膚癌發生發展密切相關［13］，XPNPEP2 可通過snail 介導上皮間質轉化（EMT）的發生從而促進宮頸癌的侵襲與轉移［7］，但目前尚未見XPNPEP2 在其他腫瘤中的報道。在本研究中，筆者用免疫組織化學方法檢測和比較72 例胃癌組織及其部分配對的60 例癌旁組織中XPNPEP2 的表達水平。統計分析顯示胃癌患者XPNPEP2 蛋白的表達水平明顯高于癌旁組織，提示XPNPEP2 在胃癌發生發展中起重要作用。研究［11］表明，EMT 與胃癌侵襲轉移密切相關。前期研究發現XPNPEP2 在宮頸癌中促進EMT 誘導宮頸癌的侵襲與轉移［7］，胃癌組織中高表達的XPNPEP2 可能亦可通過snail 介導EMT，進而促進胃癌侵襲。細胞增殖凋亡與胃癌發生發展密不可分，腫瘤增殖因子Ki67 在胃癌發展過程中扮演重要角色［12］。在組織芯片閱片過程中，筆者發現XPNPEP2 在癌旁組織近基底層細胞染色較腺上皮明顯更深，提示XPNPEP2 可能可促進胃癌細胞增殖，目前尚未有相關文獻報道。但是，在胃癌組織中XPNPEP2 的表達水平與臨床各病理參數并未見明顯相關性，這可能由于本次研究樣本較少，尚不能檢測出其差異。KM 生存曲線分析胃癌患者中XPNPEP2 蛋白高表達可能預示著較低的存活率，此外，本次研究采用Kaplan-Meier Plotte 在線數據庫分析XPNPEP2 在876 例胃癌患者中的表達與OS（總生存率）的相關性，數據庫結果與本次研究相符。進一步證明XPNPEP2 在胃癌發生發展中發揮重要作用。然而，為進一步驗證XPNPEP2在胃癌中的潛在預后價值，在COX比例風險模中進一步驗證時卻發現XPNPEP2 并不是胃癌不良預后的獨立危險因素。本次研究結果表明胃癌組織中XPNPEP2 蛋白表達水平高于癌旁組織，但不足以顯示XPNPEP2蛋白的表達水平對胃癌患者生存期有影響，后期需通過擴大樣本量等方法進一步研究。