經鼻胰島素對腦出血小鼠TLR4信號表達的影響

范楊，楊進，朱媛，余巨明，蔣國會

(川北醫學院附屬醫院神經內科，四川 南充 637000)

腦出血是一種嚴重的卒中亞型，具有高發病率、高致死率、高致殘率及高復發率的特點。而且，隨著人口老齡化、溶栓和抗凝劑的更多應用，腦出血的發病率逐漸增加[1]。迄今為止，腦出血仍無有效的治療方法[2]。大量的研究證實，腦出血后除了顱內血腫導致組織機械壓迫外，炎癥和氧化應激途徑促發血腫周圍組織繼發性腦損傷[3]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)在中樞神經系統先天免疫中起著重要作用，TLR4信號參與腦出血后神經炎癥過程[4-5]。TLR4主要在CD11b陽性小膠質細胞中表達，經核因子NF-κB信號在腦出血后早期促進炎癥細胞因子釋放，TLR4敲除或阻斷可減輕腦出血后繼發性腦損傷病理，并改善神經功能缺損[6-7]。

當前觀點認為，神經炎癥是大腦各種損傷和神經退行性疾病病情進展的關鍵因素，在不同神經疾病中腦TLRs是誘導神經炎癥起始和進展的中心環節。TLRs活化是不同器官包括中樞神經系統中誘導氧化應激、炎癥反應和胰島素抵抗的關鍵分子[8]。數十年來，大腦被認為是免疫不敏感器官，但目前的研究發現，中樞神經系統不僅有自己固有的免疫反應機制，而且在適當的條件下，外周炎癥細胞和因子可以穿過血腦屏障來進入中樞神經系統[9]。TLRs是一組在中樞神經系統中廣泛表達的糖蛋白，識別相關的分子模式(PAMPs)和內源性危險信號(破壞相關性分子模式或DAMPs)[10]。TLRs的胞內信號有兩種途徑：大多數TLRs經MyD88依賴信號通路(除TLR3外)，而TLR3和TLR4經非MyD88依賴信號通路，TLR4是唯一可依賴于這兩條途徑的TLRs，所以TLR4信號在神經炎癥中起著至關重要的作用[11]。腦出血后，紅細胞溶解產物導致小膠質細胞TLR4激活而促進炎癥細胞因子釋放，加重腦水腫與神經功能缺損。然而，應用 TLR4 特異性抑制劑阻斷TLR4激活誘發的炎癥效應，使腦出血后炎癥反應得到明顯調控，說明腦出血后TLR4激活是繼發性腦損傷重要機制，TLR4是腦出血治療的關鍵靶標。

既往的觀念認為，大腦是胰島素不敏感的器官，胰島素一直作為外周組織的降糖激素而在臨床中廣泛應用。30年前，研究者在腦內發現了胰島素和胰島素受體(insulin receptors，IR)，且有研究證據表明，腦內胰島素通過胰島素受體及其下游信號在腦卒中、腦外傷、神經變性疾病、心境及精神障礙等神經精神疾病的發生、發展和康復過程中也有至關重要的作用[12-13]。而大腦胰島素信號是否參與腦出血病理生理過程仍然不得而知。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物采用10～12 周齡的SPF級雄性C57BL/6J 小鼠25只，購于川北醫學院實驗動物中心，體重在22～24 g。實驗過程中小鼠飼養于無菌環境，潔凈水喂養，飼養環境溫度維持在21 ℃左右，相對濕度維持在50%左右，日光燈提供12 h 晝/夜周期節律。小鼠數表法隨機分為假手術組(n=5)、ICH組(腦出血組)和ICH+Ins組(胰島素干預組)，腦出血和胰島素干預組小鼠又分為12 h、和72 h組(每組n=5)。假手術組僅于麻醉后，相應部位插入微量注射針，僅有針道穿刺損傷，沒有注射自體血，不考慮顱內血腫導致繼發性腦組織損傷，依據動物實驗管理規定，盡量減少實驗動物痛苦和數量，所以僅取12 h組作為對照。胰島素干預組于術前30 min ，給予0.5 U(5 μL)門冬胰島素(諾和諾德，中國天津)，采用頭后仰位，伸頸，用10 μL移液槍緩慢交替滴入雙側鼻腔。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠自體血腦出血模型構建 術前將小鼠稱重后用4%水合氯醛360 mg/kg，稀釋后按0.1 mL/10 g體重的劑量進行動物麻醉。頭部固定后將注射針定位于前囟0.8 mm，旁開2 mm，深3.5 mm 位置；取小鼠新鮮自體尾動脈血20 μL，用微量注射泵，按2 μL/min速率勻速注射入小鼠腦紋狀體，靜止10 min后緩慢拔針，采用骨蠟封閉顱骨創口后縫合頭皮[14]。術后于相應時間點取大鼠血腫周圍部分腦組織，-80 ℃冰箱保存。采用Western blot和RT-PCR技術檢測血腫周圍組織TLR4、NF-κB和TNF-α蛋白和mRNA表達水平的變化。

1.2.2 提取RNA及RT-PCR 血腫周圍組織總RNA提取，按照試劑盒常規說明進行Trizol(Gibco，USA)。所有樣本均進行DNAse處理后完成逆轉錄cDNA合成，按照(iScriptcDNA synthesis kit，Bio-Rad，USA)試劑盒常規說明完成。樣本數據分析使用Nanodrop ND-100分析儀(Thermo Fisher Scientific Inc，USA)，樣品A260/A280比值為1.8～2.0。采用1 μg模板進行擴增，擴增試劑盒使用PCR-miX(天根，北京)。引物由上海生工合成，序列如下：TLR4上游引物為5’-AATCTGGTGGCTGTGGAG-3’，TLR4下游引物為5’-CCCTGAAAGGCTTGGTCT-3’；NF-κB上游引物為5’-TTCCAAGACTACGACAGCCACA-3’，下游引物為5’-GCCGCTTCCTCATATCCTCAAT-3’；對照為GAPDH上游引物為5’-TCACTGCCACCCAGAAGA-3’，GAPDH下游引物為5’-CCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3’。PCR循環條件為：94 ℃預變性30 s，95 ℃變性2 min，然后60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s。45個循環后于72 ℃延伸45 s。反應產物TLR4為287 bp，NF-κB為346 bp和GAPDH 為428 bp，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳。對TLR4 和NF-κB的灰度值與GAPDH灰度值的比值進行分析。

1.2.3 Western blot表達檢測 從-80 ℃冰箱中取出組織樣本，在液氮中研磨。之后用RIPA強蛋白裂解液按照說明書步驟進行蛋白提取(碧云天生物公司，江蘇)。依次進行蛋白質量濃度測量和蛋白變性等處理。使用SDS-PAGE相關試劑制備10%凝膠，隨后進行電泳和轉膜，并封閉4 h后加入兔多克隆抗體TLR4(1∶2 000，Abcam)，4 ℃過夜。次日加入辣根過氧化物酶偶聯二抗(按1∶10 000稀釋，用0.01 mol/L PBS稀釋)，室溫下平穩搖動2 h。洗膜后使用ECL顯色、拍照和分析。

1.3 統計學分析

用SPSS 18.0統計軟件，以單因素方差分析(one-wayANOVA)對結果進行分析處理。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因檢測結果

采用RT-PCR方法檢測TLR4和NF-KB的基因表達變化。TLR4條帶位置于287 bp，NF-κB條帶位置在346 bp，GAPDH位置在428 bp位置。統計結果顯示，與假手術組相比，各組TLR4和NF-κBmRNA表達水平均顯著增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與腦出血組12 h組相比，胰島素治療12 h組的兩者表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與腦出血72 h組相比，鼻內胰島素治療72 h組的TLR4和NF-κBmRNA表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 蛋白檢測結果

前述實驗檢測結果說明，胰島素治療能夠影響TLR4和NF-KB的基因表達。進一步通過Western Blot檢測TLR4和NF-KB蛋白變化，結果顯示，與假手術組相比，各組差異均有明顯統計學意義(P<0.05)。與腦出血組12 h組相比，胰島素治療12 h組的兩者表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與腦出血72 h組相比，鼻內胰島素治療72 h組的TLR4和NF-κBmRNA表達明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

大腦受各種損傷和理化因素刺激均可導致氧化應激、炎癥反應和胰島素信號受損，研究發現神經炎癥與中樞胰島素破壞密切相關。高脂飲食(HFD)或肥胖可誘導中樞胰島素抵抗，并導致的神經元活動和遷移能力降低。TLR4基因敲除或中和炎癥介質可預防這一過程，表明TLR4可能參與了中樞胰島素抵抗的誘導過程。在糖尿病的研究中發現胰島素抵抗、破壞PI3K/Akt的GSK3信號、解除TLR4激活的負反饋調節環路，均可加重TLR4活化導致的組織損傷[15-16]。

經鼻腦靶向胰島素可快速、高效的提高腦內胰島素濃度，且不經過血腦屏障(BBB)，避免了肝臟首過消除效應，除鼻粘膜輕微刺激外，幾乎無毒副作用[17]。采取頭后仰位，經鼻前庭滴注胰島素后數分鐘到達腦內，10～30 min達到峰值，持續2～6 h，且不影響外周血糖和胰島素濃度[18]。經鼻腦靶向胰島素治療，能有效糾正疾病狀態下大腦的胰島素信號降低，是腦內胰島素補充最為便捷有效的方式，在神經精神領域具有廣闊的應用前景。TLR4的高表達因是腦出血患者預后差的獨立危險因素而成為腦出血的治療靶標。本研究主要觀察經鼻腦靶向胰島素治療是否對自體血小鼠腦出血模型NF-κB和TLR4 mRNA和蛋白表達水平的影響。

本研究發現，腦出血后不同時間點NF-κB和TLR4蛋白和mRNA表達水平增高，在模型第3天達高峰。近年的研究認為，腦出血后NF-κB和TLR4表達上調與腦出血病理生理機制相關[7，19]。腦出血后小膠質細胞激活TLR4，爾后通過上調其下游核轉錄因子(NF-kB)的表達、調控TNF-α等多種炎性因子釋放，進而加重腦出血后繼發性腦損傷[20- 21]。經鼻胰島素降低腦內的氧化應激并激活抗氧化應激系統，同時，在氧化應激情況下，胰島素可以增加腦內尿酸的水平、調節谷胱甘肽過氧化物酶及谷胱甘肽還原酶的活性，從而對氧化應激產生保護作用[22]。此外，腦內胰島素對腦內β樣淀粉蛋白沉積和缺血導致的神經元損害均具有保護作用[23-24]。Ferreira等[25]的研究證實，阿爾茲海默氏病(AD)和代謝紊亂相關，大腦炎癥可通過破壞胰島素信號而嚴重影響神經元功能。鼻內胰島素可經轉錄因子(FOXO3)影響海馬的突觸的可塑性，進而改善AD患者的記憶、認知功能和神經病理損害[26]。

綜上所述，鼻內胰島素治療小鼠腦出血后TLR4表達下調，并伴有NF-kB降低。鼻內胰島素可能通過糾正腦出血創傷和顱內血腫導致繼發性腦損傷后大腦胰島素信號紊亂，從而改善中樞胰島素抵抗相關的神經炎癥反應和TLR4及下游信號的表達異常。所以，經鼻腦靶向胰島素治療可能是有效的干預腦出血后TLR4靶標的一種新措施。