子宮內膜樣腺癌組織中錯配修復蛋白和p53蛋白表達與臨床病理特征的關系

吳暢 劉海玲 趙夫娟

[摘要]目的 分析子宮內膜樣腺癌（EA）組織中錯配修復蛋白（MMRP）和p53蛋白表達與臨床病理特征的關系以及兩者的相關性。方法 本研究中的所有標本取自2017年1月～2018年12月在中南大學湘雅醫院確診并進行手術治療的EA患者。應用免疫組化Envision法檢測162例EA患者中MMRP及p53蛋白的表達情況；將4種MMRP中的1種以上表達缺失定為微衛星不穩定組（MSI組），全部陽性表達設為微衛星穩定組（MSS組）。分析MMRP與p53的表達與臨床病理特征的相關性以及兩種蛋白之間的相關性。結果 162例中，MSS組120例，MSI組42例。MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表達缺失率分別為3.7%、6.2%、10.5%及17.9%；其中共同缺失表達類型為MSH2-MSH6和MLH1-PMS2者分別為4例（2.5%）、15 例（9.3%）。MMRP表達情況在分化程度、浸潤深度方面比較，差異有統計學意義（P<0.05）。p53表達在年齡、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移方面比較，差異有統計學意義（P<0.05）。經Spearman分析得出，MSI與p53成正相關 （r=0.189，P<0.05）。結論 在EA患者中存在MMRP缺失，且MLH1、PMS2缺失表達較MSH2和MSH6多見。MSI及p53與EA的臨床病理特征關系密切，對EA的預測以及惡性程度的評估具有參考價值，且兩者成正相關，可能參與EA的發生、發展過程。

[關鍵詞]子宮內膜樣腺癌；MSH2；MSH6；MLH1；PMS2；p53；免疫組織化學

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）4（a）-0008-04

[Abstract] Objective To analyze the relationship between the expression of mismatch repair protein （MMRP） and p53 protein in endometrial adenocarcinoma （EA） tissues and the clinicopathological characteristics and the correlation between the two proteins. Methods All specimens in this study were taken from patients who were diagnosed with EA and underwent surgical treatment at Xiangya Hospital of Central South University from January 2017 to December 2018. The expression of MMRP and p53 protein in EA （162 cases） was detected by immumohistochemistry method Envision. The microsatellite instability group （MSI group） was defined as the expression deficiency of more than one of the four MMRPS， and the microsatellite stability group （MSS group） was defined as all four kinds of MMRP positive expression. The correlation between the expression of MMRP and p53 and clinicopathological features and the correlation between the two proteins were analyzed. Results There were 120 cases in MSS group and 42 cases in MSI group in 162 cases. The expression deletion rate of MSH2， MSH6， MLH1 and PMS2 was 3.7%， 6.2%， 10.5% and 17.9% respectively. Among them， 4 cases （2.5%） and 15 cases （9.3%） had the common co-deletion expression types of MSH2/MSH6 and MLH1/PMS2 respectively. There were statistical differences in the expression of MSI in the degree of differentiation， depth of infiltration （P<0.05）. There were statistical differences in the clinicopathological characteristics of EA patients′ p53， such as age， differentiation degree， infiltration depth and lymph node metastasis （P<0.05）. Spearman correlation analysis showed that there was a obvious positive correlation between MSI and p53 （r=0.189，P<0.05）. Conclusion There is MMRP deficiency in patients with EA， and the expression deficiency in MLH1 and PMS2 is higher than that of MSH2 and MSH6. MSI and p53 are closely related to the clinicopathological characteristics of EA， and have reference value for the prediction of EA and the evaluation of malignancy degree. MSI and p53 protein are positively correlated， which may be involved in the occurrence and development of EA.

[Key words] Endometrial adenocarcinoma； MSH2； MSH6； MLH1； PMS2； p53； Immunohistochemistry

子宮內膜癌（endometrial carcinoma）是世界范圍內女性常見的惡性腫瘤之一，發病率占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%[1-2]。子宮內膜癌中最常見的組織類型是子宮內膜樣腺癌（endometrial adenocarcinoma，EA），占其中的80%～85%。子宮內膜癌每年的新發病例大約是15萬例，位列女性癌癥的第五位[3]。近年來，我國子宮內膜癌的發病率有逐年上升的趨勢，且發病年齡漸趨年輕化，嚴重危害女性健康[4]。在大多數情況下，早期子宮內膜癌僅通過手術就可以治愈，發生侵襲和轉移后其預后很差。

EA常見的分子遺傳學的改變有抑癌基因PTEN的突變、腫瘤抑制基因p53的突變、KRAS原癌基因的突變及微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）。MSI涉及DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）基因的突變，導致無法修復重復序列（微衛星）中DNA復制過程中發生的錯誤。這種修復機制的喪失反過來導致包含微衛星的基因中的移碼突變的累積[5]。MMR提供了幾種遺傳穩定功能：它糾正了DNA生物合成錯誤，確保基因重組的保真度，并參與細胞周期檢查點/控制和細胞凋亡反應的最早步驟。MMR基因缺陷增加細胞惡性轉化的風險，最終導致一個或幾個與上皮完整性相關的基因的破壞[6]。p53是迄今為止發現的與人類腫瘤相關性最高的基因，野生型p53是一種抑癌基因兼凋亡誘導基因，它編碼一種DNA結合磷酸化蛋白，參與細胞周期的調控和調亡[7]。本研究采用免疫組化PV法檢測EA中錯配修復蛋白（mismatch repair protein，MMRP）和p53的表達情況，探討其與EA的臨床病理特征的關系，為EA的侵襲轉移及預后判斷提供客觀指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究中的所有標本取自2017年1月～2018年12月在中南大學湘雅醫院確診并進行手術治療的162例EA患者。年齡 29～75歲，平均（52±8）歲；有淋巴結轉移者9例，無淋巴結轉移者153例；分化程度：高分化子宮內膜樣腺癌60例，中分化子宮內膜樣腺癌53例，低分化子宮內膜樣腺癌49例；浸潤深度：黏膜內83例，淺肌層60例，深肌層19例；有脈管侵犯者5例，無脈管侵犯者157例；有神經侵犯者1例，無神經侵犯者161例。納入標準：按照2010版WHO標準經病理檢查確診為EA；術前未進行放化療；行子宮全切加雙附件切除術。排除標準：活檢標本；免疫組化的資料不完整者。該研究已經醫院醫學倫理學委員會批準，患者知情同意。所有標本均經病理檢查確診。

1.2 方法

送檢組織經4%中性甲醛液固定，常規脫水，石蠟包埋，3 μm厚度切片，HE染色，光鏡觀察。選取腫瘤與正常組織同時存在的蠟塊，4 μm厚度切片行免疫組化，采用Envision法，一抗為MSH2、MSH6、MLH1、PMS2及p53，抗體及所用免疫組化試劑均購于福州邁新生物技術開發有限公司，操作步驟按照試劑說明書進行。以上操作均用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照，每例都有HE切片作對照觀察。

1.3 結果判定

陽性結果明確，陽性信號的位置正確且染色特征正確。MSH2、MSH6、MLH1、PMS2及p53均定位于細胞核。對照組織即腫瘤周圍的正常上皮細胞、腫瘤內浸潤的淋巴細胞、間質細胞MMRP均出現細胞核著色，可作為內對照[8]。根據文獻，陽性結果判定標準為MMRP和p53在細胞核明確著色表達判定為陽性，與核染色強弱以及陽性細胞彌漫或局灶分布無關；細胞核不著色判斷為陰性。將4種MMRP中的1種以上表達缺失定為微衛星不穩定組（MSI組），全部陽性表達設為微衛星穩定組（MSS組）[3]。

1.4統計學方法

采用統計學軟件SPSS 24.0分析數據，計數資料采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 MMRP在EA中的表達情況

4種MMRP表達均定位于腫瘤細胞核。162例EA患者中，MMRP陽性者（MMS組）120 例（74%），表達缺失者（MSI組） 42例，缺失率為26%，其中，MSH2、MSH6、MLH1及PMS2的表達缺失率分別為3.7%、6.2%、10.5%、17.9%；MSH2 與 MSH6 共同缺失表達率為2.5%，MLH1 與 PMS2 共同缺失表達率為9.3%（表1）。

2.2 MMRP在EA不同臨床病理特征中的差異表達

MSI組與MSS組相比，在分化程度、浸潤深度方面比較，差異有統計學意義（P<0.05），表現為在MSI組腫瘤分化程度更低、浸潤更深。而在年齡、淋巴結轉移、脈管侵犯和神經侵犯等方面比較，差異均無統計學意義（P>0.05）（表2）。

2.3 p53在EA不同臨床病理特征中的差異表達

p53的表達定位于腫瘤細胞核。在EA中的陽性表達率為53%，在年齡、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移方面比較，差異有統計學意義（P<0.05），在脈管侵犯和神經侵犯方面比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表3）。

2.4 MMRP與p53在EA中表達的相關性

MSI與p53表達在在EA中成正相關（r=0.189，P<0.05）（表4） 。

3 討論

根據臨床病理學和分子遺傳學特征的不同，子宮內膜癌可大致分為兩大類，即Ⅰ類（雌激素依賴性腫瘤）和Ⅱ類（非激素依賴性腫瘤）。最常見的子宮內膜癌，即EA，臨床上有多種危險因素，如肥胖、糖尿病、未經產、高血壓及絕經晚[9-11]。在過去30年，在子宮內膜癌的發生、發展過程中發現許多原癌基因和抑癌基因突變、MSI等分子遺傳學的改變起著非常重要的作用并影響預后。盡管有最先進的一線手術，激素治療和化療，但腫瘤進展到晚期和腫瘤復發仍舊會導致預后不良和高死亡率，這也是影響子宮內膜癌治療的主要問題[12]。

有許多修復機制用于識別和去除各種特定類型的DNA損傷。完整DNA的恢復機制取決于細胞周期的階段，病變的類型和環境因素。然而，所有修復機制都使用細胞完整的互補DNA鏈作為模板來恢復原始鏈[13]。根據用于修復的分子和修復的時間段，細胞修復機制分為直接和間接修復機制。在復制過程中，當子DNA仍在合成時，直接修復機制由DNA聚合酶或O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）介導[14]。間接修復則涉及在合成新DNA期間發生的損傷并且在合成過程之后發生。它本質上是一個后復制過程，通常彌補直接修復的不可修復性。在此合成過程中DNA復制的許多蛋白質也參與與輔助。間接修復機制進一步分為三類：切除修復，重組修復和MMR。

DNA MMR是在DNA穩態中起關鍵作用的重要酶系統之一，其涉及修復分裂體細胞中DNA復制過程中發生的特定類型的錯誤[15]。該系統的遺傳損失導致修復機制減少，因此導致潛在突變的加速積累（稱為MSI）[16]。到目前為止，已發現MMR基因多達九種，其中最常見發生突變的四個MMR基因分別為MSH2、MSH6、MLH1、PMS2；其中任何一個的表達缺失都將導致MMR系統功能異常，進而促進腫瘤的發生和進展[17]。

p53基因是目前研究得最為廣泛及深入的腫瘤基因之一，它的突變與多種腫瘤的發生、發展密切相關[7]。p53基因基因發生突變后其編碼的蛋白失去了其相應的功能，表現為癌基因的形態，進一步誘導腫瘤的發生、發展[18]。EA中約10%可以檢測到p53基因突變，多見于3級EA[19]。

本研究結果顯示，MSH2缺失者占3.7%，MSH6表達缺失占6.2%，MLH1缺失者占10.5%，PMS2缺失者占17.9%，提示這4種蛋白的突變情況與EA的發生、發展有著密切的相關性。EA中MMRP表達缺失以MLH1和PMS2為主，這一結果與國外的研究[20]基本一致。本研究結果中，MMRP表達情況在在分化程度、浸潤深度方面比較，差異有統計學意義（P<0.05）；p53的陽性表達率為53%，且其表達在年齡、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移方面比較，差異有統計學意義（P<0.05）；MSI與p53成正相關（r=0.189，P<0.05）。

綜上所述，MMRP（MSH2、MSH6、MLH1、PMS2）和p53在EA的臨床病理診斷中有重要參考價值，MMRP及p53與EA的臨床病理特征關系密切，對該疾病的預測以及惡性程度的評估具有重要的參考價值，且兩者成正相關，可能參與了EA的發生、發展過程。

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（收稿日期：2019-01-24 本文編輯：許俊琴）