地塞米松體外下調Eomes表達抑制1型輔助性T細胞功能

(南華大學附屬郴州醫院1.轉化醫學研究所，2.腎內科，3.肝膽外科，湖南 郴州423000)

糖皮質激素在免疫系統中發揮強有效的調節作用[1]，可抑制多種免疫細胞如T細胞、肥大細胞等激活和趨化，誘導嗜酸性粒細胞凋亡，并抑制炎癥部位一系列炎癥介質的釋放[2]。糖皮質激素在臨床治療炎癥[3]和自身免疫疾病[4]的效果明確，而激素介導的免疫調節作用機制并未完全闡明。幼稚CD4+T細胞可分化為1型輔助性T細胞(Type 1 T helper cells，Th1)、Th2、Th17等細胞[5]。其中Th1細胞主要產生γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素2(Interleukin-2，IL-2)等細胞因子參與免疫應答[6]；Th2細胞參與細胞外病原體的清除[7-8]，Th17細胞通過產生標志性細胞因子介導炎癥免疫應答[9]。本文通過地塞米松體外72 h處理外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，探討其對健康人外周血輔助性T細胞亞群分布、增殖、凋亡、功能及轉錄水平的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集健康志愿者外周血，排除人類免疫缺陷病毒、梅毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒等感染性疾病，且近期未使用糖皮質激素的健康志愿者作為本次研究納入對象。該研究在南華大學附屬郴州市第一人民醫院倫理委員會和志愿者知情同意下進行。本次研究對象共45例，其中男37例，女8例；年齡19～47歲，平均(30.10±5.77)歲。

1.2 主要試劑

LIVEDEAD為Intitrogen公司生產；鼠抗人趨化因子受體6(Chemokine receptor 6，CCR6)PE-Cyanine7 (11A9)、T盒轉錄因子(T-box expression in T cells，T-bet) PE (eBio4B10)、CXC趨化因子受體3(C-X-C chemokine receptor type3,CXCR3) PE-610 (CEW33D)、脫中胚蛋白(Eomesodermin，Eomes)-APC (WD1928)、CD3 FITC (UCH71)、CD3 APC-eFluor 780 (SK7)、細胞核相關抗原(nuclear-associated antigen ki-67，ki-67)-PE-eFluor 610(20Raj1)購自eBioscience公司；鼠抗人CD4 BUV-737 (SK3)、CD8 APC-CY7 (SK1)、IFN-γ PE-CF (B27)、Granzyme B PE (GB11)、膜聯蛋白V(Annexin V)-PE凋亡檢測試劑盒購自BD Biosciences公司；Cytofix/Cytoperm、Fixation/Permeabilization solution kit購自BD Biosciences公司；Fixation/Permeabilization Reagents、Human TruStain FcXTM(Fc Receptor Blocking Solution)、Foxp3/Transcription Factor 染色液試劑購自eBioscience公司；地塞米松、佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)為Sigam-Aldricha公司生產。

1.3 儀器

應用MoFlo XDP流式細胞分選儀(美國Beckman公司)獲取并分析細胞，軟件FlowJo V10.0分析流式數據。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞準備 采集健康志愿者外周血6～10 mL，經淋巴細胞分離液梯度離心分離PBMCs，凍存液凍存于-196 ℃液氮罐中備用。細胞解凍后，加5 mL R1640培養基洗去凍存液，用1 mL含10%胎牛血清的R1640完全培養基(Gibco)重懸細胞，并置于48孔細胞培養板，37 ℃、5% CO2培養箱中過夜培養。細胞活性恢復后計數并將同一樣本按1×106個細胞每孔，分為地塞米松組(終濃度為1×10-7mol/L)、對照組(細胞完全培養液培養)并種于96孔平底板中，放置細胞培養箱中72 h。

1.4.2 細胞表面染色 將上述樣本轉移至96孔V底板， 100 μL每孔live/dead (工作濃度1∶1 000)重懸，室溫避光孵育30 min 。細胞染色時先染含5 % Human TruStain FcXTM抗體懸液25 μL每孔，4 ℃孵育5 min，以阻斷Fc非特異性結合；按總體積50 μL每孔染相應的抗體CD3、CD4、CXCR3、CCR6、CD8混勻后，4 ℃孵育30 min，700×g離心4 min。凋亡檢測時，據試劑盒說明書染Annexin V、7-AAD抗體，常溫孵育15 min，400 μL試劑盒相應緩沖液重懸后，一小時內檢測。

1.4.3 胞內細胞因子刺激 PBMCs用地塞米松處理72 h后轉移至96孔U底板，用PMA (50 ng/mL)加Ionomycin (1 μg/mL )再刺激4～6 h，其中刺激細胞1 h后加Golgistop(工作濃度1∶1 500)阻斷胞內細胞因子釋放到胞外，5 h后檢測胞內細胞因子表達。

1.4.4 胞內細胞因子染色 因PMA刺激會導致CD4+T細胞表達減少，因而使用CD8-T細胞群反設門為CD4+T細胞。Fixation/Permeabilization solution 100 μL每孔重懸細胞后4 ℃避光孵育20 min，洗滌細胞兩次后，按上述染色步驟，染抗IFN-γ、GzmB抗體，并流式檢測。

1.4.5 核內轉錄因子染色 細胞經表面抗體染色后，使用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer 100 μL每孔室溫避光孵育40 min。洗滌細胞后，按上述染色步驟，染抗T-bet、Eomes或ki-67抗體，并流式檢測。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 地塞米松體外處理增加CD4+T細胞的頻數

復蘇健康人PBMCs 23例，按照細胞數1×106個每孔，將同一細胞分為對照組與地塞米松處理組。地塞米松處理PBMCs 72 h后，PBMCs經流式抗體表面染色檢測發現：與對照組相比，地塞米松處理增加CD4+T細胞的比例(P<0.01，表1)。

表1 地塞米松處理組與對照組各表型的比例 (%)

與對照組比較，aP<0.01,bP<0.05

2.2 地塞米松體外處理改變輔助性T細胞的分布

為明確地塞米松體外72 h處理對CD4+T細胞亞群的影響，進一步分析Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞的比例變化(圖1，表1)時發現：與對照組相比，地塞米松刺激后可使Th2、Th17細胞比例顯著增加(P<0.05)，而Th1細胞顯著降低(P<0.01)。

2.3 地塞米松體外處理抑制Th1細胞的功能

PBMCs經佛波酯和離子霉素體外再刺激6 h后，流式抗體胞內細胞因子染色(圖2)分析發現：地塞米松刺激Th1細胞后，其功能性因子IFN-γ和GzmB的表達顯著減少(P<0.01，表1)。

2.4 地塞米松體外處理對Th1細胞增殖與凋亡的影響

細胞破核染色后檢測增殖標記ki-67的表達情況，發現地塞米松處理對Th1細胞表達ki-67的比例變化無統計學差異(圖3A，表1)。細胞刺激72 h后直接染Annexin V、7-AAD抗體檢測細胞凋亡情況，發現地塞米松處理后Th1細胞上早期凋亡細胞比例無明顯差異，晚期凋亡細胞比例顯著增加(P<0.05，圖3B，表1)。

圖1 地塞米松影響輔助性T細胞亞群分布輔助性T細胞的流式設門策略，CXCR3+CCR6-定義為Th1細胞、CXCR3-CCR6-定義為Th2細胞、CXCR3-CCR6+定義為Th17細胞(n=23)

2.5 地塞米松體外處理抑制Th1細胞的轉錄

PBMCs經核內染色(圖4)，發現地塞米松處理后Th1細胞表達轉錄因子T-bet無統計學差異，而Eomes表達顯著減少(P<0.01，表1)，且Eomes/T-bet比值也顯著下調(P<0.01，表1)。

圖2 地塞米松對Th1細胞上功能性細胞因子IFN-γ、GzmB表達的影響A：Th1細胞上IFN-γ表達的典型流式圖(n=11)；B：Th1細胞上GzmB表達的典型流式圖(n=11)

圖3 地塞米松對Th1細胞增殖、凋亡的影響A：Th1細胞上ki-67表達的典型流式圖(n=11)；B：Th1細胞早期凋亡(Annexin V+7-AAD-)，晚期凋亡細胞(Annexin V+7-AAD+)的典型流式圖(n=10)

圖4 地塞米松對轉錄因子T-bet、Eomes表達的影響A：Th1細胞上T-bet表達的典型流式圖(n=11)；B：Th1細胞上Eomes表達的典型流式圖(n=11)

3 討 論

在本文中，與對照組相比，地塞米松體外72 h處理增加CD4+T細胞的比例，顯著減少Th1細胞，增加Th2、Th17細胞的比例。有研究發現地塞米松可抑制Th1細胞免疫，促進Th2細胞免疫應答[10]，Zhao等[11]研究也證實，在體外實驗中地塞米松可增加Th17細胞的頻率。表明地塞米松可改變細胞亞群的比例，減少Th1細胞、并促進CD4+T細胞向Th2、Th17細胞分布。

T-bet、Eomes為調控Th1細胞分化的主要轉錄因子，T-bet高表達于Th1細胞，調節Th1細胞分化并促進IFN-γ的表達。體外實驗中激活的Th1細胞也可表達Eomes[12]，當T-bet缺失時，Eomes對IFN-γ的產生以及Th1細胞的發育起重要的調節作用。而Th1細胞可誘導GzmB表達，GzmB作為胞外蛋白酶在介導細胞凋亡過程中起重要作用，胞外GzmB的高表達與多種炎癥性疾病明顯相關[13-14]。有研究表明轉錄因子T-bet、Eomes的表達與調節編碼效應細胞因子如IFN-γ，以及編碼重要細胞溶解功能如穿孔素、GzmB的基因表達有關[15]。

檢測功能性因子的表達情況發現：地塞米松體外處理后，Th1細胞IFN-γ、GzmB表達減少。有研究證實地塞米松顯著減少IFN-γ的表達[3]，地塞米松也可阻斷GzmB的合成以及激活并影響其活性[16]。IFN-γ、GzmB是Th1細胞的功能性細胞因子，提示地塞米松72 h處理可抑制Th1細胞的功能，從而使得Th1細胞功能受損。

Ki-67是表達于細胞周期G1、G2、S期，但不表達于M期的核抗原，已被廣泛用作細胞增殖的標志。細胞凋亡是一個調控良好的細胞死亡過程，在細胞穩態的發育和維持中具有重要作用，Annexin V和7-AAD常用于鑒定細胞凋亡。本研究檢測細胞增殖和凋亡的實驗結果表明，地塞米松體外處理不影響Th1細胞的增殖，但能顯著促進Th1細胞的凋亡，與Kailin Xing 等[17]研究結果一致。

T-bet、Eomes是Th1細胞的主要轉錄因子，緊接著檢測轉錄因子水平的變化發現：地塞米松72 h處理后，Th1細胞上T-bet的表達無明顯改變，但Eomes的表達以及Eomes/T-bet的比值顯著減少。已有研究表明：炎性條件下，地塞米松可降低T-bet mRNA的表達水平[18]。而T-bet也參與調控濾泡輔助性T細胞(Follicular help T cell，Tfh)分化、發育，本研究中Th1細胞T-bet的表達無明顯改變可能是地塞米松作用于除Th1細胞之外的另一群細胞如Tfh細胞，主要減少其T-bet的表達，該猜想仍需進一步研究證實。Eomes、Eomes/T-bet的比值在Th1細胞中顯著降低，提示地塞米松可抑制Th1細胞的轉錄水平，打破Eomes與T-bet之間的轉錄平衡，使得Th1細胞轉錄功能受損。轉錄因子T-bet、Eomes調節IFN-γ、GzmB表達，而IFN-γ又可調控轉錄因子的表達，故轉錄水平受損將影響特異性細胞因子的表達，而特異性細胞因子受抑制后又可反過來影響轉錄因子的表達[19]。

綜上所述，地塞米松體外干預健康人外周淋巴細胞可促進Th1細胞凋亡從而減少Th1細胞的比例，抑制其轉錄因子Eomes的表達，并破壞轉錄因子T-bet和Eomes之間的轉錄平衡，進而抑制Th1細胞的功能。本文結果顯示，在健康人群中地塞米松72小時干預對Th1細胞比例、功能性細胞因子的分泌乃至轉錄水平的影響，為探討地塞米松的免疫調節機制提供參考。