血漿同型半胱氨酸水平與MTHFR基因變異的關聯研究

隋小芳,徐 男,黃佳濱,費秀斌,陳尚君,王鳳玲*

(1.佳木斯大學附屬第一醫院 老年病科；2.佳木斯大學,黑龍江 佳木斯154002)

高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是由于同型半胱氨酸代謝相關的酶功能障礙引起的，血漿同型半胱氨酸水平大于或等于15.0 μmol/L被稱作高同型半胱氨酸血癥[1]。Hcy升高的常見原因有遺傳、體內葉酸、維生素B6、B12缺乏、慢性腎功能不全及生活方式等因素[2]，但在發展中國家，有關該基因的遺傳數據結果仍有爭議，需進一步探討。

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是由MTFHR基因編碼的，MTHFR催化5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸，是Hcy轉化為蛋氨酸的必要條件,是蛋氨酸循環通路的關鍵酶[3,4]。HHcy最常見的遺傳原因可能是C677T中C到T和A1298C中A到C的轉換[5]。但是在MTHFR(C677T和A1298C)中，突變的頻率和酶的活性受不同的種族和地理位置的影響，存在一定的差異[6,7]。

綜上，本研究旨在通過隨機招募長期居住在佳木斯城區且沒有血緣關系的漢族中、老年人，經病例對照設計研究，探討中國東北人群血漿同型半胱氨酸水平與MTHFR基因變異的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究總共隨機納入466例受試者，均為長期居住在我國東北，佳木斯城區且沒有血緣關系的漢族人群；平均年齡(63.11±8.53)歲，男性231名。受試者在2016年10月至2017年3月經佳木斯大學附屬第一醫院招募進入臨床檢查并分組，高同型半胱氨酸血癥組(HHcy組)有206例、正常同型半胱氨酸血癥組(Hcy組)有260例受試者。

高同型半胱氨酸血癥的診斷標準：Hcy≧15 μmol/L[1]。所有受試者排除肝功能不全、腎功能不全、和惡性疾病患者，以及排除一些潛在的混雜因素。本研究已經通過佳木斯大學附屬第一醫院倫理委員會的認可，且已經獲得所有研究對象的知情同意書，同意提供外周靜脈血做基因型檢測分析。

1.2 實驗方法

1.2.1同型半胱氨酸檢測

所有受試者空腹8 h后采集靜脈血5 ml于紫色抗凝真空采血管中，采用循環酶法測得受試者血漿同型半胱氨酸水平。

1.2.2基因型檢測

采集所有受試者靜脈血2 ml于紫色抗凝真空采血管中，放置-20℃冰箱中冷藏保存。DNA提取使用傳統的實驗方法(酚氯仿方法)。采用聚合酶鏈式反應-限制片段長度多態性對SNP進行基因型分析，并用高分辨溶解曲線進行基因型分析。為了保證基因分型的質量，我們隨機選擇了3個基因型樣品進行直接測序,未見差異。

1.3 統計學處理

本研究中進行的所有數據統計檢驗均為雙尾，P<0.05認為有統計學差異。應用軟件SPSS 19.0進行數據的處理和統計學分析。哈迪溫伯格平衡檢驗驗證樣本的群體代表性；樣本均值的組間比較使用t檢驗，分類變量用頻數表示；運用χ2檢驗分析C677T突變、A1298C突變與受試者的一般臨床資料；通過SHEsis在線軟件分析比較HHcy組與Hcy組人群中基因組合(單倍型)的交互作用。

2 結果

2.1 兩組研究對象臨床基線數據的比較

所有研究對象的臨床基線數據及其既往所患疾病的信息，見表1。兩組的男/女性別比較(143/63 vs.88/172，P<0.01),兩組的年齡比較(65.15±9.03 vs.62.37±8.20，P=0.04)，進一步將年齡按照WHO年齡劃分標準分為：中青年(40-59 歲)、年輕老年人(60-69 歲)、老年人(>70 歲)的界限分組，分析結果仍有統計學意義(P<0.01)；在空腹血糖和膽固醇等臨床指標無明顯差異(P>0.05)。

表1 兩組研究對象在臨床基線數據的比較

注：M:男,F:女,Hcy:同型半胱氨酸TG:甘油三酯,TC:總膽固醇,LDL:低密度脂蛋白,HDL:高密度脂蛋白,T2DM:2型糖尿病,HTN:高血壓.*表示P<0.05.

2.2 MTHFR C677T和A1298C的基因型和等位基因頻率的單獨關聯分析

MTHFRC677T和A1298C基因中的基因型和等位基因頻率在HHcy組、Hcy組間的比較，見表2和表3。在C677T中與正常Hcy組比較，HHcy組TT基因型明顯增高(47.58% vs.21.92%，P<0.01)、T等位基因頻率明顯高于正常Hcy組(69.17% vs.50.58%，P<0.01)，差異有統計學意義；在A1298C中，HHcy組CC基因型明顯低于正常Hcy組(1.94% vs.8.85%，P<0.01)、C等位基因頻率顯著低于正常Hcy組、A等位基因頻率高于正常Hcy組，分別為(19.90% vs.26.54%)、(80.10% vs.73.46%，P=0.02)，差異有統計學意義。

表2 兩組MTHFR C677T基因多態性的基因型及等位基因頻率分布

注：OR:比值比，CI:置信區間；P<0.05有統計學意義。

表3 兩組MTHFR A1298C基因多態性的基因型及等位基因頻率分布

注：P<0.05為有統計學意義。

2.3 比較高同型半胱氨酸血癥攜帶者中基因組合(單倍型)的交互作用

將MTHFR C677T和A1298C兩位點的基因組合(單倍型)結果見表4。結果顯示：HHcy組與Hcy組比較時，C677T的C和A1298C的A存在正向交互作用[P=0.003，OR(CI)=0.634(0.469-0.859)<1]，C677T的C和A1298C的C存在正向交互作用[P<0.01,OR(CI)=0.440(0.298-0.648)<1]；C677T的T和A1298C的A存在正向交互作用[P<0.01,OR(CI)=1.842(1.418-2.394)>1]；C677T的T和A1298C的C無正向交互作用[P=0.055,OR(CI)=1.586(0.988-2.546)>1]，無統計學意義。

表4 MTHFR C677T和A1298C兩位點的基因組合(單倍型)與HHcy組和Hcy組之間的比較

注：@基因單倍型的多態性順序：C677T和A1298C，通過使用SHEsis在線分析軟件測得χ2和P值。

3 討論

高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是基因和遺傳因素共同調控的結果[8]。MTHFR C677T基因多態性中C等位基因到T等位基因的替換過程中，MTHFR酶活性分別降低了70%和35%左右，進而Hcy水平增高[9,10]。在A1298C基因位點中，Zappacosta1等人的研究結果表明AA基因型的人群Hcy普遍高于CC型，Jadeja等人研究表明A1298C基因多態性與HHcy明顯相關[11,12]。在本次研究結果顯示A1298C基因多態性中攜帶AA基因型的人群數量普遍高于CC型，并且1298A可能與HHcy相關，研究結果與前人相同。在兩位點(C677T和A1298C)的交互作用分析中，C677T的C和A1298C的A、C677T的C和A1298C的C的交互作用，可能是高同型半胱氨酸血癥的保護因素，而C677T的T和A1298C的A交互作用，可能是高同型半胱氨酸血癥的致病因素。但未來需要擴大樣本量深入研究。

綜上所述，本研究表明高同型半胱氨酸水平與MTHFR 677T和1298A基因變異有關。