特應性皮炎患者外周血中Th22、Treg細胞及其細胞因子表達的研究

李 志，楊婷婷，李文哲

(1.大連市中心醫院 檢驗科,遼寧 大連116033；2.大連醫科大學基礎醫學院,遼寧 大連116044)

特應性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種發病過程漫長且反復發作的皮膚病，在兒童期發病較高，呈上升趨勢，雖然治療的方法有很多[1]，但是由于其發病機制沒有全部弄清，并不能進行特效治療，給患者帶來巨大的痛苦。因此對特應性皮炎的發病機制進行深入的研究有著重大的意義。AD的發病機制十分復雜，目前普遍認為本病是由先天免疫缺陷和后天環境因素相互作用引起的。而CD4+T細胞在AD的發病中所發揮重要的作用已得到普遍認同。CD4+T細胞是一類功能復雜的細胞群，根據其所產生的細胞因子不同，可以分為多個亞群。傳統的研究發現AD的發病機制與Th1/Th2細胞失衡有著密切的關系，近年來，多種CD4+T細胞亞群的發現更加完善了Th1/Th2細胞失衡理論。很多學者已經通過大量的研究發現T細胞22(Th22)、調節性T細胞(Treg)等細胞均參與AD的病理過程并在其中扮演著非常重要的角色。皮膚中的Th22大多數是由樹突狀細胞和朗格漢斯細胞分化而來，其分泌的IL-22能夠破壞皮膚的屏障功能。Cosmi等發現[2]，Treg細胞就有抑制Th1和Th2的作用，并且對于Th2活性的抑制低于Th1。本研究主要通過檢測AD患者的外周血中Th22細胞和Treg細胞的比例以及血清IL-22、TGF-β的表達，并分析這些細胞及其細胞因子與AD嚴重程度之間的關系，從而進一步的討論Th22細胞和Treg細胞在AD患者發病機制中的價值，以便于臨床采取更好的治療措施來控制患者的病情。

1 材料與方法

1.1 標本采集

選取2017年8月至2018年3月在大連市中心醫院就醫的特應性皮炎患者52例初診病例作為患者組，這些患者的病情嚴重程度按照歐洲特應性皮炎評分標準(SCORAD)進行評分[3]，按分值從高到低分為3組，>50分為重度組，25-50分為中度組，0-25分為輕度組。其中輕度AD組20例，中度AD組18例，重度AD組14例。4組對象在性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。20例健康人為對照組。

1.2 主要試劑

FITC標記-抗人CD4單克隆抗體(CD4-FITC)、IntraPrepTM固定劑以及破膜劑均購自美國Beck-Man公司；PE-IL-22，PE-Foxp3 單抗均購自美國eBioscience公司；淋巴細胞分離液、RPMI-1640培養基等均購自美國Sigma-Aldrich公司；人IL-22 ELISA試劑盒、人TGF-βELISA試劑盒，購自美國R&D公司。(2)主要儀器設備：流式細胞儀購自美國Beck-Man公司。

1.3 樣本采集和處理

采集受檢者在清晨空腹條件下的靜脈血各3 ml于EDTA抗凝管和促凝管中,EDTA抗凝管中的血用于Treg細胞的檢測以及用密度梯度離心法Ficoll分離單個核細胞(PBMCs)后對Th22細胞的檢測。促凝管中的血分離血清后，取上層血清置于-70℃的冰箱中保存用于ELISA檢測細胞因子IL-22和TGF-β的濃度。

1.4 實驗方法

1.4.1Th22細胞和Treg細胞的流式檢測

將分離后的外周血單個核細胞(PBMCs)進行兩次洗滌后重懸于RPMI-1640培養液中，然后將CD4-FITC單抗加入細胞懸液中進行混勻后避光孵育20 min。再在標記后的PBMCs中加入刺激培養液，使得細胞濃度調整至1×106/ml，隨后置入培養箱孵育4 h后，用PBS洗滌兩次。再將洗滌后的細胞懸液采用IntraPrepTM試劑進行固定和破膜，將破膜后的懸液再經過兩次洗滌后平均分成2管，分別加入PE-IL-22和同型對照IgG1-PE各10 μl,再避光孵育30 min后洗滌兩次。最后,采用流式細胞儀測定已經標記細胞的熒光強度。

取外周全血200 μl加入CD4-FITC單抗，用于Treg細胞的標記，將標記后的全血樣本用PBS洗滌兩次后，用試劑ItraPrepTM 進行固定和破膜。將破膜后的懸液再經過兩次洗滌后平均分成2管，分別加入PE-Foxp3抗體和Foxp3對照抗體進行細胞內細胞因子的標記,孵育30 min。最后,采用流式細胞儀測定已經標記細胞的熒光強度。

1.4.2ELISA檢測血清中IL-22和TGF-β濃度

將已經分離好的上層血清取出后，用ELISA的方法檢測血清中細胞因子IL-22和TGF-β的濃度，在檢測時嚴格按照IL-22和TGF-β各自的ELISA試劑盒的操作說明進行操作。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 外周血中Th22和Treg細胞的比例

與健康對照組相比，輕、中、重度特應性皮炎患者外周血中Th22 細胞的比例均顯著增高(P<0.000 1)，Treg細胞的比例顯著降低(P<0.000 1)；與輕度、中度特應性皮炎患者相比，重度特應性皮炎患者外周血Th22 細胞的比例顯著增高(P<0.000 1)，Treg 細胞的比例顯著降低(P<0.000 1)，見表1。

表1 各組受試者外周血中Th22和Treg細胞表達比列

注：與健康對照組相比較，*P<0.0001，△P<0.0001，☆P<0.0001；與輕度、中度AD患者相比較★P<0.0001。

2.2 血清中IL-22、TGF-β的水平

與健康對照組相比，輕、中、重度特應性皮炎患者血清中IL-22 細胞因子的水平均顯著增高(P<0.0001)，中、重度特應性皮炎患者TGF-β細胞因子的水平顯著降低(P<0.0001)，輕度特應性皮炎患者TGF-β細胞因子的水平與健康對照組無顯著差異(P=0.1430)；與輕度、中度特應性皮炎患者相比，重度特應性皮炎患者血清中IL-22 細胞因子的水平顯著增高(P<0.0001)，TGF-β細胞因子的水平顯著降低(P<0.0001)，見表2。

表2 各組受試者血清中IL-22和TGF-β細胞因子表達水平

注：與健康對照組相比較，*P<0.0001，△P<0.0001，☆P<0.0001；與輕度、中度AD患者相比較★P<0.0001。

3 討論

特應性皮炎通常開始發生于嬰幼兒時期，其病程漫長呈反復發作的過程[4]。在大約三分之一的患者中，AD與過敏表現有關(如哮喘、食物過敏、季節性過敏)。最近，協會也報告了其他的疾病，包括類風濕性關節炎、胃腸病、系統性紅斑狼瘡。還有數據顯示這種疾病是增加心血管疾病的危險因素[5]?；颊咂つw往往會發生劇烈瘙癢，嚴重影響了患者的正常生活。在發達國家中兒童的AD患病率可高達10%-20%[6]。在我國，AD的患病率也是穩中有升[7，8]。

AD的發病機制十分復雜，是免疫、遺傳、環境、病理、生理等各種各樣的因素相互作用從而產生的結果。傳統的觀點認為免疫畸變是AD起始發展的一個主要事件(“從內到外的假設”)。而現在有另一種假設認為AD是因為表皮屏障存在固有缺陷。由于表皮屏障缺陷，刺激物或者是過敏原可以非常輕易地穿透表皮屏障，然后會誘發免疫反應(“由外到內假設”)。近年來，由于在AD患者中發現絲聚合蛋白突變使得表皮屏障的缺損比免疫畸變得到了更多的支持[9]。皮膚屏障要發揮正常功能必須依賴絲聚合蛋白，因此絲聚合蛋白基因(FLG基因)的缺陷是導致皮膚屏障缺陷的至關重要的因素。早在2006年McLean等通過對北歐人群進行調查研究，發現近20%的AD病例與FLG基因的突變失活有關[10]。然而FLG基因發生突變的大多數患者病情最終也得到緩解，況且還存在著大部分AD患者的FLG基因并沒有發生突變，因此單純的FLG基因突變并不能解釋所有的AD發病機制。與此同時，claudin蛋白與皮膚屏障的缺損也有著非常重要的關系，它在角質層不能發揮正常功能時，可以起到額外的屏障作用[11]。Kuo等[12]的研究已經證實AD患者存在著表皮claudin蛋白含量下降的臨床表現。不僅Th2細胞與表皮claudin蛋白的表達呈負相關，而且皮損區Th2細胞因子水平與表皮claudin蛋白的表達也呈負相關，這提示Th2細胞因子具有使上皮細胞claudin蛋白下調的作用。

Th22 是和Th2細胞、Th1 細胞等不一樣的新型輔助性T 細胞亞群，主要通過分泌IL-22等的細胞因子從而對皮膚屏障功能產生破壞作用[13，14]。Th22細胞的作用主要與疾病的內在機制有關，它可誘導表皮增生，也可抑制蛋白參與不真皮分化和皮膚屏障功能，并上調包括S100A8和S100A9的抗菌肽。本研究發現，特應性皮炎患者的病情嚴重程度與Th22細胞及IL-22細胞因子的表達成正相關。是因為在發炎的皮膚中，Th22可以通過增強趨化因子和TNF-α誘導的細胞因子來促進免疫反應[15]，并且在角化細胞中，IL-22降低了絲聚合蛋白的表達，加劇了表皮屏障功能障礙[16]。它主要是通過抑制角質絲聚合蛋白轉錄后加工酶的表達從而使絲聚合蛋白的表達降低，進而加重皮膚的損傷[17]。任小麗[18]等研究證實Th22細胞在特應性皮炎患者中分泌的IL-22升高，且與特應性皮炎患者的病情嚴重程度和發病機制有著一定的關系，與本研究結果相似。Th22在特應性皮炎的免疫發病機制中起著重要的作用，但是其具體以什么方式參與的還有待研究，隨著越來越徹底的研究會使針對細胞因子的靶向治療在特應性皮炎的治療中發揮重要作用。

Tregs通過抑制不同免疫細胞的分化和增殖，在免疫反應中有著很關鍵的作用[19]。本研究發現，Treg細胞及TGF-β細胞因子在特應性皮炎患者體內表達減少。Treg主要是通過產生TGF-β和IL-10來抑制免疫反應的，其機制是通過表達CTLA-4，然后CTLA-4通過攜帶酪氨酸抑制基序(ITIM)與B7結合后從而抑制T細胞的增殖和分化[20]。Cosmi等[21]發現Treg細胞具有抑制Th1和Th2的作用，并且對Th1的抑制強于Th2，從而導致Th1/Th2的比例失衡。Ma L[22]等研究發現Treg細胞及TGF-β與特應性皮炎存在著一定的關系，在特應性皮炎中比例降低，與本研究結果相似。然而Ou LS[23]等研究中指出AD患者外周血中Treg細胞明顯升高，與本研究結果截然相反，可能是由于AD的發病機制十分復雜，其他的免疫因素改變了Treg細胞的數量，從而削弱和掩蓋了Treg細胞及其細胞因子在AD中的作用。隨著研究的深入，會使通過對TGF-β細胞因子的靶向治療以及利用抗CTLA-4單抗來阻斷Treg細胞從而減輕Treg對免疫的抑制作用成為可能。

不同的免疫細胞通過其分泌的細胞因子在機體的微環境中相互作用，發揮各自的功能，維持機體的免疫穩態。Th22和Treg細胞及其細胞因子IL-22和TGF-β在特應性皮炎發病過程中發揮重要作用，可以為特應性炎的實驗室診斷提供重要參考，對特應性炎的療效評估具有重要意義。