結核感染血清學診斷技術的應用評價

翁繩鳳,邢俊蓬,郭 威

(1.北京老年醫院 檢驗科;2.北京老年醫院 感染疾病科,北京100095)

結核病疫情嚴峻,但由于其臨床癥狀和體征不典型,診斷和鑒別診斷較困難,導致漏診和誤診率較高,因此迫切需要快速簡便準確的實驗室診斷方法,指導臨床早期診斷。近年來,基于γ-干擾素體外釋放試驗建立起來的免疫學檢測手段,在診斷結核分枝桿菌感染方面顯示出良好的敏感性和特異性[1]。血清學(抗原、抗體、蛋白芯片)檢測依然是結核病輔助診斷的重要手段之一[2],主要是操作簡便,快速實用。這些手段對結核病診斷價值備受學者的廣泛關注,為進一步了解結核感染T細胞斑點試驗和結核抗體試劑盒在診斷結核病的應用價值,本研究通過回顧性分析,對結果進行比較,評價結核抗體檢測和T-spot.TB試驗在結核病診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象及診斷標準

1.1.1研究對象 回顧性分析2015.11-2016.11期間疑似結核的住院患者臨床資料(544例)。其中菌陽肺結核患者210例(均通過細菌學診斷確診),平均年齡(62.93±20.37)歲；菌陰肺結核患者268例(均通過臨床進行診斷),平均年齡(64.80±20.30)歲；非結核菌病患者66例,平均年齡(69.98±17.89)歲。三組患者同時進行過T-spot.TB,TB-DOT和ASSURE TB結核抗體檢測。

1.1.2診斷標準 (1)菌陽肺結核診斷參照原衛生部《WS288-2008肺結核診斷標準》[3]執行。(2)菌陰肺結核：以中華醫學會結核病學分會制定的《肺結核診斷和治療指南》[4]為依據，3次痰涂片及一次痰培養均為陰性的肺結核,具體診斷標準是1)典型的肺結核臨床癥狀和胸部x線表現；2)抗結核藥物治療有效；3)臨床可排除其他非結核性肺部疾病；4)PPD(5IU)皮膚試驗強陽性,血清抗結核抗體陽性；5)痰結核分枝桿菌PCR探針檢測陽性；6)肺外組織病理證實為結核病變；7)支氣管肺泡灌洗液(BALF)檢出抗酸分枝桿菌；8)支氣管或肺部組織病理證實結核病變。具備1-6條中的三項或7-8條中任何一項可確診。(3)非結核病患者,排除結核病診斷的呼吸系統疾病患者,包括肺炎,支氣管擴張,慢性支氣管炎,慢性阻塞性肺部疾病及肺惡性腫瘤,診斷參照《實用內科學》[5]執行。

1.2 試驗及方法

1.2.1T-spot.TB試驗 試劑盒是由英國Oxord Immunotec 公司生產。

①標本要求 采集外周全血4 ml,無需空腹,需用肝素/肝素鈉抗凝,不能使用EDTA抗凝管；樣本要求新鮮(在8 h內完成實驗)；室溫保存與運輸；不能冷凍或冷藏；避免震蕩引起溶血影響結果。

②外周血T淋巴細胞分離 抽取外周靜脈血4 ml至肝素鈉抗凝的無菌管,混勻,避免血液分層。緩緩加入到等體積的淋巴分離液的無菌離心管中,離心1 600×g 30 min,可見外周血單個核細胞(PBMC)存在于云霧層中,吸取淋巴細胞層,用1640培養液洗滌離心2次。顯微鏡下計數細胞數,用細胞培養液調至細胞數2.5×106/ml。

③結果判讀標準 依據試劑盒說明書,如果陰性對照孔斑點形成細胞數(SFC)<6,檢測孔SFC減去陰性對照孔SFC≥6,可判讀為陽性,<6判讀為陰性。如果陰性對照孔斑點形成細胞數(SFC)≥6,檢測孔SFC為陰性對照孔2倍時,可判讀為陽性。

1.2.2結核分枝桿菌抗體檢測

①TB-DOT檢測 試劑盒由上海奧普生物醫藥有限公司生產,可定性檢測人血清中結核分枝桿菌抗體,用于臨床結核病輔助診斷。

本試劑盒利用斑點免疫膠體金滲濾技術,將結核分枝桿菌特異性膜蛋白抗原分離純化,點樣并固化在硝酸纖維膜上,膜上TB抗原捕獲人血清樣品中結核分枝桿菌抗體,被捕獲的結核IgG抗體可用葡萄球菌A蛋白(SPA)膠體金綴合物標記呈色(SPA能與IgG特異性結合),形成紅色斑點,根據是否出現紅色斑點即可判斷陰陽結果,從而判斷是否存在結核分枝桿菌抗體。

②ASSURE TB檢測 試劑盒由新加坡MP生物醫學亞太私人有限公司生產ASSURE TB(膠體金法),用于定性檢測人血清、血漿或全血中的結核分枝桿菌IgG抗體。

本試劑盒(MP Diagnostice (MPD)ASSURE TB Rapid Test)應用間接固相免疫層析技術,當檢測樣本從樣本孔向上遷移時,固定在膜上的結核抗原會與試驗樣本(血清、血漿或全血)中的特異性抗體形成抗原-抗體復合物。這種復合物與標記有相應二抗的膠體金結合,形成肉眼可見的紫紅色條帶,質控線上的蛋白A也同時與金標二抗結合作為樣本正確加入的標記。如果在檢測線處(T)和質控線處(C)出現紫色條帶,則結核分枝桿菌抗體為陽性。任何深度的條帶均應判作陽性。

1.3 統計學方法采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析,應用卡方檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況544例患者中,男253例,女291例。菌陽組210例,年齡19-93(歲),平均年齡(62.93±20.37)歲；菌陰組268例,年齡18-94(歲),平均年齡(64.80±20.30)歲；對照組66例,年齡21-94(歲),平均年齡(69.98±17.89)歲。三組在性別和年齡上差別無統計學意義,P>0.05。

2.2 檢測結果三組患者采用T-spot TB和兩種結核抗體金標試劑進行檢測,結果見表1。菌陽肺結核患者 210例,其中Tspot-TB檢測陽性率為84.28%(177/210),TB-DOT為64.28%(135/210),ASSURE TB為62.85%(132/210)。菌陰肺結核患者268例,其中Tspot-TB檢測陽性率為76.87%(206/268),TB-DOT為44.77%(120/268),ASSURE TB為39.55%(106/268)。Tspot-TB檢測方法的陽性率與兩種抗體檢測方法差異有統計學意義,P均為0.000,見表2。兩種結核抗體檢測方法的陽性率之間差異無統計學意義(χ2=1.210,P=0.3)。對照組66例患者中,檢測特異性分別為Tspot-TB 78.79%(52/66),TB-DOT 77.27%(51/66),ASSURE TB 75.76%(50/66),三種方法特異性差異無統計學意義(χ2=0.173,P=0.917)。

表1 不同組別患者采用T-spot TB和兩種結核抗體金標試劑的檢測結果

表2 T-spot TB試劑盒與兩種結核抗體試劑盒檢測結核病組與對照組患者的診斷價值

注：表中的χ2值、P值分別為兩種結核抗體檢測靈敏度與T-spot TB靈敏度的比較結果

3 討論

全球20億人口感染結核[6],現有活動性結核患者2000萬,新增活動性結核患者約900萬/年,每年200-300萬患者死亡。我國是22個結核病高負擔國家之一,結核病早期診斷,早期規范治療尤為重要。由ELISPOT發展而來的T-spot TB試驗是用于檢測特異性T細胞分泌的γ-干擾素,并據此判斷是否感染結核分枝桿菌。劉紅等[7]對1084例疑似肺結核患者進行研究,T-spot TB綜合敏感度為86.2%,特異度為91.1%；萬榮等[8]研究中顯示168例結核病患者T-spot TB綜合敏感度為86.9%；T-spot TB對免疫功能正常的成年人活動性結核病診斷的敏感度為83%-97%,綜合敏感度90%[9,10]。本研究478例結核病患者T-spot TB診斷的綜合敏感度為80.13%,略低于上述報道,可能是因為病例大多是老年人,老年肺結核患者機體免疫功能相對低下且多有合并癥,可能影響T-spot TB敏感度[8]。T-spot TB在非結核病組中的陰性率為78.79%,低于國內外其他研究[7-10],可能與患者年齡及例數多少有關。

T-spot TB對菌陽肺結核和菌陰肺結核患者的檢測敏感度分別為84.28%和76.27%,差異無統計學意義,P>0.05。結核抗體試劑盒TB-DOT對菌陽肺結核和菌陰肺結核患者的檢測敏感度分別為64.28%和44.77%；ASSURE TB分別為62.85%和39.55%,差異有統計學意義,P<0.05,有利于結核病療效的監測。這與劉毅[11]等報道的38 kDa蛋白血清抗體檢測在診斷活動性肺結核上有較好的診斷和應用價值的結果一致。TB-DOT檢測主要針對外膜抗原,ASSURE TB檢測主要針對38 kDa抗原(相對分子質量為38000的抗原,簡稱為“38 kDa抗原”),而T-spot TB試驗是針對早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP10)。

T-SPOT.TB與兩種抗體檢測方法在診斷結核病敏感性的差異有統計學意義(P<0.05),尤其對菌陰患者有顯著差異(76.87% vs 44.77%和39.55%)。T-spot TB試驗在結核感染的檢出方面具有較高的靈敏度,但不能鑒別結核感染是活動性,陳舊性或潛伏性,因此在臨床上T-spot TB陰性排除結核病意義較大,本次研究中三個試驗的特異性分別為78.79%(T-SPOT.TB),77.27%(TB-DOT)和75.76%(ASSURE TB),差異無統計學意義。T-spot TB陽性時應根據患者臨床癥狀,胸片及其他實驗室檢查,如抗酸桿菌涂片、結核抗體、PPD、ESR等綜合考慮,最終判斷患者是否為活動性肺結核。

綜上所述,T-SPOT.TB試驗在結核感染診斷中顯示較高的敏感度和特異度,尤其在診斷菌陰肺結核患者中,其靈敏度優于結核抗體,兩種方法聯合應用對結核病血清學診斷具有輔助診斷價值。