miR-1197負調控Smad3抑制結腸癌細胞SW620的增殖、侵襲、遷移能力及S期細胞周期的聚集相關研究

張隆陶,王 勁,張貽慶,崔貴醫

(焦作市人民醫院 肝膽胰疝外科，河南 焦作454000)

結腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，目前手術是結腸癌主要的治療手段，但術后復發和轉移限制了治療效果[1]。因此探究結腸癌的侵襲轉移分子機制、尋找有效靶點對結腸癌的診療具有重要意義[2]。microRNA(miRNA)是近年來研究較多的一類內源性小分子非編碼RNA，其在多種人類惡性腫瘤中出現表達異常，充當癌基因或抑癌基因，在惡性腫瘤的演進過程中發揮重要作用。經大量研究證實，在結腸癌細胞中存在多個miRNA分子表達異常，且與結腸癌患者的Dukes分期、分化程度、遠處轉移及生存預后等臨床病理特征之間存在相關性，提示miRNA分子可能參與結腸癌的演進[3,4]。Smad3是轉化生長因子β(TGF-β)信號通路中重要的轉運蛋白[5]，而TGF-β/Smads信號通路介導的EMT加速腫瘤細胞的侵襲及轉移。本研究旨在分析miR-1197的表達水平與結腸癌的相關性，研究miR-1197與Smad3對結腸癌細胞增殖，遷移，侵襲能力及細胞周期的影響，探尋miR-1197在結腸癌中發揮的作用及其相關機制，為診斷及治療結腸癌尋找新靶點。

1 材料與方法

1.1 研究樣本采集

實驗組織標本來自本院病理科2016年8月至2018年5月結腸癌患者的結腸癌組織及癌旁正常組織共50例，其平均年齡(65.04±12.38)，均經組織病理學檢查證實,未接受化療和/或放療，所有組織標本采集時先切成小塊，迅速置于凍存管中液氮保存，6h 后移至-80℃冰箱備用。

1.2 外周血采集

納入研究的結腸癌患者均于清晨空腹狀況下進行外周靜脈血抽取，采用一次性血清分離膠管，抽取外周靜脈血約3 ml；待血清析出后以1 000 g離心10 min，取上層血清保存至-80℃冰箱待檢測。

1.3 細胞培養

人類結腸癌細胞系SW620用含10%的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、100 u/ml青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養基，置于含5%CO2，溫度維持在37℃中的恒溫箱中培養。

1.4 細胞轉染

將生長狀態良好的SW620細胞以約 5×105/孔鋪于6孔板，待細胞在6孔板中的生長融合度達60%時，按照轉染試劑LipofectamineTM2000 試劑說明書，分別轉染 negative control miRNA mimics，miR-1197 mimics及共轉染miR-1197 mimics和Smad3，分別作為對照組，miR-1197 mimics轉染組和miR-1197 mimics+Smad3轉染組。

1.5 qRT-PCR檢測

按照Trizol試劑盒說明書中步驟提取細胞和組織總RNA，按照反轉錄試劑盒的說明書將總RNA進行RNA逆轉錄，合成cDNA。按照qRT-PCR 試劑盒說明書進行進行 PCR 反應。miR-1197水平以 U6 為內參，Smad3的mRNA水平以GAPDH 為內參，qRT-PCR結果以2-△△Ct表示，每個樣本重復3次。

1.6 熒光素酶報告基因法檢測

利用miRBase預測miR-1197與Smad3可能的作用位點。構建Smad3野生型3’-UTR熒光素酶報告基因質粒pMIR-Smad3-wt和突變型報告基因質粒pMIR-Smad3-Mut。將pMIR-Smad3-wt、pMIR-Smad3-Mut與miR-1197 mimics和negative control miRNA mimics共轉染進SW620細胞，轉染24 h后，去除培養基，每孔加入100 μl被動裂解液(Passive Lysis Buffer,PLB)，室溫下將培養，待細胞裂解后，將每組20 μl樣本轉移至發光用96孔板上，使用酶標儀配套軟件進行結果分析。相對熒光素酶活性 (Relative luciferase activity)=螢火蟲熒光素酶活性(Firefly luciferase activity)/海腎熒光素酶活性(Renilla luciferase activity)。

1.7 Western Blot

采用RIPA裂解液提取細胞或組織蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，按每泳道以50 μg總蛋白進行10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，采用PVDF膜轉移蛋白，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗兔抗Smad3(1∶500)，內參GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。ECL液暗室發光顯影，采集圖像并分析。

1.8 Tranwell實驗檢測細胞侵襲

將Matrigel凝膠置于4℃過夜；次日將液化的Matrigel與培養基以1∶6的比例稀釋。在上室加入50 μl Matrigel 稀釋液，以包被濾膜；將培養板置于孵箱中4 h，令包被液晾干。取生長狀態良好的各組細胞，胰蛋白酶消化并使用含10% BSA的培養基重懸細胞，調整細胞密度為1×106/ml。將濾膜孔徑為8 μm 的Transwell小室放置于24孔板中；在下室加入600 μl 含10%血清的培養基；在上室加入100 μl 細胞懸液；將培養板放入孵箱，常規培養24-48 h。取出小室，用PBS淋洗3次；將小室置于95%乙醇中固定 5 min；在0.5%結晶紫染色液中染色10 min后，用 PBS 漂洗去除未結合細胞的染色液。用棉簽輕拭去小室濾膜上層的細胞，在顯微鏡下觀察濾膜下層細胞并拍照并計數。

1.9 CCK8檢測細胞增殖

取各組細胞用培養液配成單細胞懸液，調整細胞數為1.5×104個/ml，將細胞均勻鋪于96孔板中，每孔200μl細胞懸液，置于37℃培養箱中培養。24 h后每孔加CCK8溶液20 μl，繼續孵育4 h。酶標儀設定波長450 nm，進行吸光度檢測。

1.10 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移

將生長狀態良好的各組細胞以2×105個/ml接種于6孔板內，每孔2 ml。待細胞長成單層棄去培養液，在每孔中央劃出一個劃痕，洗去死亡細胞，顯微鏡下拍照，觀察12 h時細胞劃痕處細胞運動變化。

1.11 流式細胞法檢測細胞周期

各組細胞以每孔5×105個接種于6孔板中，轉染48 h后收集細胞并用預冷的PBS洗滌細胞1次，然后設定1 200 RPM離心5 min，用預冷的PBS重懸，逐滴將細胞懸液加入預冷的70%乙醇中，置于4℃ 固定過夜。去除乙醇后用PBS洗滌2次并加入100 μl RNase A，37℃水浴30 min，接著添加400 μl PI染色并混勻，4℃避光 30 min，最后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.12 構建結腸癌裸鼠移植瘤模型

選用SPF 級 BALB/c雄性裸鼠8只，4-5周齡，體重13-16 g。動物飼養于22℃恒溫，40-75%濕度，12 h光/暗周期條件下，自由獲取水和食物。所有裸鼠隨機分為對照組(n=4)和miR-1197處理組(n=4)。取轉染了miR-1197 mimics，negative control miRNA mimics的SW620細胞配置成濃度約為 2×107個/ml 單細胞懸液，每只裸鼠左前肢腋窩皮下接種0.2 ml細胞懸液。接種后每3天用游標卡尺測量每只裸鼠移植瘤的最大直徑a和最小徑b,計算瘤體積，計算公式為:V=1/2×a×b2，3周后采用頸椎脫臼法處死全部裸鼠，剝離瘤體，稱重，拍照，甲醛固定。

1.13 免疫組化

將組織標本置于4%多聚甲醛固定液中固定48 h后，常規石蠟切片脫蠟水化。滴加3% H2O2室溫孵育10 min以消除內源性過氧化物酶活性。使用PBS沖洗5 min×2次，切片置于檸檬酸鹽緩沖液并采用微波加熱法以修復抗原。加入5% 的正常羊血清封閉，室溫孵育20 min。加入Ki67抗體(1∶100)，4℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶200)，37℃孵育30 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。采用DAB顯色后，蘇木精室溫染色2 min，而后進行脫水和中性樹脂封片。顯微鏡觀察切片陽性信號，并進行計數統計。

1.14 統計學方法

2 結果

2.1 miR-1197在結腸癌患者血清中的表達與臨床特征的相關性

qRT-PCR檢測結果顯示，結腸癌患者血清中miR-1197表達水平與腫瘤分化程度，淋巴轉移，遠端轉移，腫瘤浸潤深度和腫瘤直徑相關臨床指標發展程度呈負相關(P<0.05)，與性別和年齡無關(表1)。

表1 miR-1197在結腸癌患者臨床特征的相關性

2.2 miR-1197在結腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達

qRT-PCR檢測結果顯示，相比癌旁正常組織，結腸癌腫瘤組織中miR-1197的表達水平顯著降低(P<0.01)(圖1A)，并且miR-1197在發生遠端轉移腫瘤組織中的表達水平顯著低于未轉移腫瘤組織(P<0.01)(圖1B)。提示miR-1197可能與結腸癌的發生及發展有關。

圖1 miR-1197在結腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達

注：A.miR-1197在結腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達水平；B.miR-1197在發生遠端轉移腫瘤組織和未轉移腫瘤組織的表達；(**，表示P<0.01，差異具有統計學意義)。

2.3 miR-1197對Smad3的靶向調控作用

采用miRBase預測miR-1197的潛在靶基因，結果顯示，Smad3的 3′-UTR區域存在與miR-1197形成互補結合的位點(圖略)。在SW620細胞中共轉染miR-1197mimics，negative control miRNA mimics (miR-NC)以及構建的Smad3野生型3′-UTR熒光素酶報告基因質粒pMIR-Smad3-wt和突變型報告基因質粒pMIR-Smad3-Mut，雙熒光素酶檢測結果顯示，miR-1197高表達可明顯抑制pMIR-Smad3-wt的熒光素酶活性(P<0.01)，但對pMIR-Smad3-Mut的熒光素酶活性無明顯影響(圖2A)。另外，qRT-PCR檢測結果顯示，相比對照組，轉染miR-1197 mimics的細胞中Smad3的mRNA水平明顯降低(P<0.01)(圖2B)。Western blot檢測結果也表明，miR-1197高表達可明顯下調Smad3蛋白的表達(圖2C)。上述實驗結果表明，miR-1197通過結合Smad3的 3′-UTR來靶向調控Smad3的mRNA及蛋白表達。

圖2 miR-1197結合Smad3的 3′-UTR來抑制Smad3的表達

注：A.雙熒光素酶報告基因法檢測熒光素酶活性；B.qRT-PCR實驗檢測Smad3的mRNA水平；C.Western blot檢測Smad3蛋白的表達水平；(**，表示P<0.01，差異具有統計學意義)。

2.4 Smad3在結腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達

采用Western blot檢測結腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中Smad3的蛋白表達。結果顯示，腫瘤組織中Smad3的蛋白表達顯著高于癌旁正常組織(圖3A)。同時，qRT-PCR檢測結果也顯示結腸癌腫瘤組織中Smad3的mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)(圖3B)。

2.5 miR-1197與Smad3對結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移及細胞周期的調控

在SW620細胞中轉染negative control miRNA mimics (miR-NC)，miR-1197 mimics和Smad3，采用CCK8法檢測各組細胞增殖能力，結果顯示，miR-1197 mimics轉染組的OD值顯著低于對照組，而miR-1197 mimics+Smad3轉染組的OD值顯著高于miR-1197 mimics轉染組(P值均<0.01)(圖4A)。流式細胞法檢測結果顯示，miR-1197 mimics轉染組S期細胞比值顯著降低，而miR-1197 mimics+Smad3轉染組S期細胞比值顯著升高(P值均<0.01)(圖4B)。采用Tranwell實驗檢測細胞侵襲能力，結果顯示，轉染miR-1197 mimics后，侵襲細胞計數顯著降低。而共轉染miR-1197 mimics和Smad3后，侵襲細胞計數顯著升高(P值均<0.01)(圖4C)。細胞劃痕實驗結果顯示，miR-1197 高表達可顯著降低細胞遷移能力，而同時上調miR-1197 mimics和Smad3的表達后，細胞遷移能力顯著上升(P值均<0.01)(圖4D)。上述結果表明，miR-1197可抑制SW620細胞的增殖、侵襲、遷移及S期細胞周期的聚集，但Smad3過表達可逆轉這種抑制效果。

圖3 Smad3在結腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織的表達

注：A.Western blot檢測結腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中Smad3的蛋白表達量；B.qRT-PCR檢測結果結腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中Smad3的mRNA表達量；(**，表示P<0.01，差異具有統計學意義)。

2.6 miR-1197在結腸癌裸鼠移植瘤模型中的作用

將negative control miRNA mimics (miR-NC)，miR-1197 mimics轉染進SW620細胞并注射到裸鼠皮下以構建結腸癌裸鼠移植瘤模型。細胞接種21天后，檢測結果顯示，miR-1197 mimics處理組的腫瘤體積及重量均顯著低于對照組(P值均<0.01)(圖5A-B)。Ki67染色結果顯示,相比對照組，miR-1197 mimics處理組裸鼠中細胞增殖能力顯著降低(圖5C)。上述結果表明，在結腸癌裸鼠移植瘤模型中，上調miR-1197的表達可抑制結腸癌細胞的增殖及腫瘤生長。

3 討論

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，具有發病率高，5年生存率低等特點腫瘤侵襲和轉移是導致結腸癌患者死亡及影響預后的重要因素，但具體機制尚不清楚，因此尋找并研究結腸癌新靶點非常重要[6]。MicroRNAs(miRNAs)是一類小分子高度保守的非編碼RNA[7]。近年來大量研究數據表明，其其突變、異位或表達水平的變化影響惡性腫瘤發展過程[8,9]。同時多種miRNAs 已被證實在結腸癌的發生及發展發揮了重要作用，例如，Wang等研究發現miR-106a通過直接調控TGFER2而促進結腸癌的轉移[10]；Zhang 等人的研究發現miR-7能夠靶向YY1蛋白的表達調節結腸癌的發生[11]。在本研究中，首先發現了結腸癌患者血清中miR-1197表達水平與腫瘤分化程度，淋巴轉移，遠端轉移，腫瘤浸潤深度和腫瘤直徑相關臨床指標呈負相關；并且miR-1197在結腸癌腫瘤組織中的表達水平顯著低于癌旁正常組織，在發生遠端轉移腫瘤組織中的表達水平顯著低于未轉移腫瘤組織。上述結果提示miR-1197可能與結腸癌的發生及發展存在相關性。

圖4 miR-1197與Smad3對結腸癌細胞增殖、侵襲、遷移及細胞周期的調控

注：A.CCK8法檢測SW620細胞增殖能力；B.流式細胞法檢測SW620細胞S期細胞比值；C.Tranwell實驗檢測SW620細胞侵襲能力；D.細胞劃痕實驗檢測SW620細胞的遷移能力；(**，表示P<0.01，差異具有統計學意義)。

圖5 miR-1197在結腸癌裸鼠移植瘤模型中的作用

注：A.miR-1197模擬物的腫瘤體積；B.miR-1197模擬物的腫瘤重量；C.Ki67染色觀察miR-1197模擬物的SW620細胞中陽性信號及增殖效果；(**，表示P<0.01，差異具有統計學意義)。

miRNAs主要與其靶基因的mRNA 3′UTR(untranslated region)非編碼區域結合，通過翻譯抑制或下調靶基因的mRNA來影響蛋白質的翻譯，從而調控不同的生理及病理過程。因此，為明確miR-1197在結腸癌中的作用機制，首先需確定其在結腸癌中調控的靶基因。本研究使用miRBase發現 Smad3的 3′-UTR區域存在與miR-1197形成互補結合的位點，并通過雙熒光素酶報告基因實驗進行了驗證。并且我們還進一步發現在SW620細胞中，miR-1197高表達可以下調Smad3的mRNA及蛋白的表達水平。表明miR-1197可負向調控靶基因Smad3的表達水平。

Smad3是Smad家族的成員，其不僅在TGF-β信號通路中起著細胞內調控作用，而且在多種人類腫瘤細胞的侵襲及轉移中扮演重要角色[12]。研究證明TGF-β/Smads信號通路在維持和促進上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal Wansition，EMT)過程中起重要作用[13]，而后者被認為是腫瘤轉移的關鍵啟動步驟[14,15]。本研究發現，在結腸癌腫瘤組織中Smad3的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于癌旁正常組織，并且其與miR-1197表達水平的變化與結腸癌細胞的生物學行為密切相關。我們發現miR-1197高表達能抑制SW620細胞的增殖、侵襲、遷移能力及S期細胞周期的聚集，但上調Smad3的表達水平可以逆轉miR-1197的這種抑制效果。表明miR-1197是通過抑制靶基因Smad3的表達水平參與調控結腸癌細胞的生物學行為。進一步，我們通過構建結腸癌裸鼠移植瘤模型觀察miR-1197在結腸癌中的作用，結果顯示，miR-1197可作為抑癌基因在結腸癌裸鼠移植瘤模型中抑制結腸癌細胞的增殖及腫瘤生長。

綜上所述，本研究闡述了miR-1197的異常低表達與結腸癌的發生及發展密切相關，揭示了miR-1197通過負調控靶基因Smad3的表達水平抑制結腸癌細胞的生物學行為及腫瘤的生長，在結腸癌中發揮抑癌基因作用。因此，miR-1197可能成為結腸癌診斷及治療的新靶點及研究方向。