丹參酮 IIA抑制長春新堿誘導化療痛維持期痛覺過敏及其機制

付寶軍,姜靜靜,黃玉瓊,林宗航,李 恒

(廣州醫科大學附屬第六醫院·清遠市人民醫院 麻醉科,廣東 廣州511518)

隨著我國惡性腫瘤發病率的逐年增高，抗腫瘤藥物在臨床藥物治療中扮演著越來越重要的角色，但是這些藥物引起的近期和遠期毒副作用也在不斷增加，其中化療藥物如長春堿類、鉑類及紫杉醇類等引起的神經病理性疼痛(Neuropathic pain NP)是極其常見的不良反應之一。化療誘導的神經病理性疼痛(Chemotherapy-induced Neuropathic Pain,CINP)可表現為痛覺超敏(allodynia)和痛覺過敏(hyperalgesia)[1]。目前，由于CINP的機制尚不明確，國內外均尚未發現有效的治療藥物。近年來研究發現，膠質細胞活化在CINP發生和發展中發揮重要作用，激活的膠質細胞繼而促進TNF-α、IL-6等炎性因子的產生和釋放,這些促炎因子增強神經元的敏感性，誘發神經病理性疼痛[2,3]。丹參酮IIA(Tanshinone IIA)是從傳統中藥丹參中提取的脂溶性成分之一，是近年來國內外學者對中藥單體中研究較多、最為穩定、且有明確的分子結構的有效活性成分，最近研究發現丹參酮有明顯鎮痛效應[4,5]，并且丹參酮IIA通過抑制免疫反應和膠質細胞活化提高脊神經結扎大鼠機械縮足反射閾值和延長熱縮足反射潛伏期[6]。基于以上證據，本研究采用化療誘導的神經病理性疼痛模型，探討丹參酮 IIA對化療痛維持期的抑制作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑實驗采用SPF級健康Sprague-Dawley大鼠，由廣州醫科大學實驗動物中心提供[(動物生產許可證號：SCXK(粵)2014-0012)]。所有實驗操作程序均經廣州醫科大學實驗動物福利與應用委員會批準，遵守國際衛生學會《實驗動物福利和應用指南》。抗GFAP和OX42抗體購于美國Abcam公司，抗β-actin抗體購于谷歌生物科技有限公司，TNF-α、IL-6ELISA試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司，注射用硫酸長春新堿購于浙江海正藥業股份有限公司，Tanshinone IIA注射液購于江西國藥有限公司。

1.2 長春新堿動物模型的制備及給藥方法證實成功誘導化療痛Sprague-Dawley大鼠50只，按隨機數字表法分為5組：對照組(Control)、化療痛組(CINP)、Tanshinone IIA 10 mg/kg組(CINP+Tan10)、Tanshinone IIA 20 mg/kg 組(CINP+Tan20)、Tanshinone IIA 50 mg/kg組(CINP+Tan500)，每組10只。大鼠進行隔日腹腔注射125 μg/kg長春新堿(共計7次)，第1次注射長春新堿當天視為1 d，于第7天通過檢測MWT和TWL變化確定化療藥物誘導的神經病理性疼痛模型(對照組大鼠除外)建立是否成功。從第8天開始連續7天采用不同劑量的Tanshinone IIA治療大鼠。對照組和化療痛組用生理鹽水(腹腔注射劑量5 ml/kg)作為對照。給藥前、給藥后1、7、10、14天用von frey測痛儀和熱刺痛儀分別測定大鼠MWT和TWL；給藥后14天Western Blot方法檢測GFAP蛋白和OX42蛋白表達；ELISA檢測脊髓TNF-α、IL-6濃度變化。

1.3 MWT的測定用von Frey纖維絲以up-down法推算50%縮足閾值[7]：將一有機玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)置于金屬篩網上,待大鼠在有機玻璃箱中適應15 min后,用von Frey纖維絲垂直刺激大鼠后肢足底中部,持續時間≤4 s,大鼠出現抬足或舔足行為視為陽性反應,否則為陰性反應。測定首先從2 g開始,當該力度的刺激不能引起陽性反應,則給予相鄰大一級力度的刺激;如出現陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺激,如此連續進行,直至出現第一次陽性和陰性反應的騎跨,再連續測定4次。最大力度為15 g,大于此值時記為15 g。每次刺激間隔30 s。

1.4 TWL的測定將有機玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上,按Hargreaves法[8]用熱痛刺激儀照射大鼠足底。照射開始至大鼠出現抬腿回避時為TWL。自動切斷時間為20 s,以防止組織損傷。熱刺激強度在整個實驗過程中維持一致。每只動物測定5次,每次間隔3 min,取后3次平均值為大鼠TWL值[9]。

1.5 Western Blot檢測烏拉坦麻醉，斷頭處死大鼠，冰上取出脊髓腰膨大部位，加入裂解液進行勻漿，4℃下12 000 rpm離心5 min，并進行BCA蛋白定量。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠，濃縮膠電泳條件為80伏恒壓，分離膠電泳條件為120伏恒壓，當溴酚藍染料前端電泳至分離膠末端處時即停止電泳，轉膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，加入-Actin(兔抗大鼠，1∶2 000)，P38MAPK(小鼠抗大鼠，1∶1 000)，GFAP (小鼠抗大鼠，1：500)，OX42 (兔抗大鼠，1∶500)，4℃9陣育 過夜后TBST洗膜3次，每次10 min。加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶3000)，HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室溫孵育2 h后TBST洗膜4次，每次10 min。ECL反應、顯、定影后使用圖像分析系統進行數據分析。

1.6 ELISA檢測脊髓TNF-α、IL-6濃度變化大鼠深麻醉(大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg)后，在冰上迅速取出脊髓腰膨大段(L4-5)，按按組織凈重(g)：稀釋液體積(mL)=1∶9的比例加入預冷的生理鹽水。勻漿后于4℃,3500 r/min下離心10 min(離心半徑5 cm)，提取上清液并在80℃保存。按試劑盒說明書檢測蛋白并繪制標準曲線，計算出樣品濃度。

2 結果

2.1 Tanshinone IIA對大鼠運動行為的影響

Tanshinone IIA(10 mg/kg、20 mg/kg、50 mg/kg)連續腹腔注射4天對正常大鼠運動行為無影響。結果見圖1。

2.2 Tanshinone IIA對化療痛維持期大鼠MWT的影響

給藥前各組大鼠的MWT差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，腹腔注射長春新堿4次后(7天)，大鼠MWT均顯著性降低(P<0.001)，并且一直持續到本實驗觀察時間點14天，提示長春新堿誘導化療痛大鼠模型成功。與化療痛組相比較，應用Tanshinone IIA劑量組(20 mg/kg、50 mg/kg)治療3、7天，大鼠MWT明顯升高(P<0.01,P<0.001)，并且兩個劑量組之間差異有統計學意義(P<0.05)，而Tanshinone 10 mg/kg組有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)表明Tanshinone IIA能減輕化療痛維持期大鼠的機械痛覺過敏，結果見圖2。

圖1 丹參酮IIA對正常大鼠運動行為的影響

The score of each group was normalizd as the precentage of the baseline value(n=4/goup).Control,normal rats;Tan10,normal rats treated with tanshinone IIA 10mg/kg;Tan20,normal rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;Tan50,normal rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

圖2 丹參酮IIA對長春新堿誘導的神經病理性疼痛大鼠機械縮足反射閾值的影響

###P<0.001 compared with CINP group;*P<0.05 and**P<0.01 compared with CINP+Tan20 group.Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

2.3 Tanshinone IIA對化療大鼠維持期TWL的影響

給藥前各組大鼠的TWL差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組相比，腹腔注射長春新堿4次后(7天)，大鼠MWT均顯著性降低(P<0.001)，并且一直持續到本實驗觀察時間點14天，提示長春新堿誘導化療痛大鼠模型成功。與化療痛組相比較，應用Tanshinone IIA劑量組(20 mg/kg、50 mg/kg)治療3、7天，大鼠TWL明顯升高(P<0.01,P<0.001)，并且兩個劑量組之間差異有統計學意義(P<0.05)，但Tanshinone10 mg/kg組有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。提示Tanshinone IIA可以減輕化療痛維持期大鼠的熱痛覺過敏。結果見圖3。

圖3 丹參酮IIA對長春新堿誘導的神經病理性疼痛大鼠熱縮足反射潛伏期的影響

###P<0.001 compared with CINP group;*P<0.05 and**P<0.01 compared with CINP+Tan20 group.Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10 mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

2.4 Tanshinone IIA對化療痛維持期大鼠脊髓GFAP蛋白表達的影響

Western Blot結果顯示：與對照組相比，腹腔注射長春新堿7次(14天)化療痛組大鼠脊髓GFAP表達顯著升高(P<0.01)，與化療痛組相比，Tanshinone IIA 50 mg/kg組和Tanshinone IIA 20 mg/kg組大鼠脊髓GFAP表達則明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且Tanshinone IIA 50 mg/kg組和Tanshinone IIA 20 mg/kg兩組之間差異有統計學意義(P<0.05)，Tanshinone IIA 10 mg/kg組雖有降低趨勢，但差異無統計學意義，提示Tanshinone IIA可以抑制化療痛維持期大鼠脊髓GFAP的表達。結果見圖4。

2.5 Tanshinone IIA對化療痛維持期大鼠脊髓OX42蛋白表達的影響

Western Blot結果顯示：與對照組相比，腹腔注射長春新堿7次(14天)后化療痛組、Tanshinone IIA 10 mg/kg組、Tanshinone IIA 20 mg/kg組、Tanshinone IIA 50 mg/kg組大鼠脊髓OX42蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。提示Tanshinone IIA不能抑制化療痛維持期大鼠脊髓OX42蛋白的表達或者提示化療痛組大鼠脊髓OX42蛋白表達與基礎值相當，結果見圖5。

圖4 丹參酮IIA對長春新堿誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓GFAP表達的影響

#P<0.05 and##P<0.001 compared with CINP group;**P<0.01 compared with Control group.Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10 mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

圖5 丹參酮IIA對長春新堿誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓OX42表達的影響

Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

2.6 Tanshinone IIA對化療痛維持期大鼠脊髓TNF-α、IL-6蛋白表達的影響

ELISA結果顯示：與對照組相比，腹腔注射長春新堿7次(14天)后化療痛組大鼠脊髓TNF-α、IL-6表達顯著升高(P<0.01)，與化療痛組相比，Tanshinone IIA 50 mg/kg組和Tanshinone IIA 20 mg/kg組大鼠脊髓TNF-α、IL-6表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)，Tanshinone IIA 10 mg/kg組有降低趨勢，但差異無統計學意義(P<0.05)。提示Tanshinone IIA可以抑制化療痛維持期大鼠脊髓TNF-α、IL-6的表達。結果見圖6，圖7。

圖6 丹參酮IIA對長春新堿誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓TNF-α表達的影響

##P<0.01 compared with CINP group;*P<0.05 and**P<0.01 compared with Control group(n=5/group).Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

3 討論

化療藥物誘導的神經病理性疼痛其機制至今仍不完全清楚，因此缺乏有效治療手段。盡管如此，藥物治療在治療手段中占有很大比重，目前，已嘗試的治療藥物主要有：阿片類藥物嗎啡、局部治療藥物5%利多卡因貼劑、抗驚癲癇藥加巴噴丁和三環類抗抑郁藥阿米替林。

阿片類藥物鎮痛藥強，但由于其依賴性和戒斷性、惡心嘔吐和呼吸抑制等副作用限制在化療藥物誘導的神經病理性疼痛患者中應用[10]；5%利多卡因貼劑其局限性為應用于定位比較明顯的神經病理性疼痛[11]；抗癲癇藥物加巴噴丁治療化療誘導的神經病理性疼痛患者研究結果有很大分歧[12-14]，因此此類藥物用于化療誘導的神經病理性疼痛的治療仍需進一步探討；三環類抗抑郁藥阿米替林可減輕糖尿病性神經病理性疼痛因其心臟毒性患者無法耐受。因此，迫切開發和尋找新的藥物治療化療藥物誘導的神經病理性疼痛藥物具用重大意義。

圖7 丹參酮IIA對長春新堿誘導的神經病理性疼痛大鼠脊髓IL-6 表達的影響

#P<0.05 and##P<0.01 compared with CINP group;*P<0.05 compared with Control group(n=5/group).Control,normal rats;CINP,vincristine-induced neuropathic pain rats treated with vehicle;CINP+Tan10,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 10 mg/kg;CINP+Tan20,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 20 mg/kg;CINP+Tan50,Vincristine-induced neuropathic pain rats treated with tanshinone IIA 50 mg/kg.

丹參酮IIA是丹參酮(是中藥丹參根的脂溶性成分)中含量最高，活性最為穩定的成份，分子結構明確有抗氧化和抗炎作用，并且對心腦血管疾病、腫瘤等疾病有潛在治療作用。丹參酮IIA的鎮痛作用已在脊神經結扎模型、糖尿病神經病理痛模型、骨癌痛模型中得到證實，但在化療誘導的神經病理性疼痛中應用還未見報道，本研究行為學顯示：腹腔注射長春新堿4次后，證實穩定化療痛模型制作成功，在繼續使用長春新堿的同時，加用丹參酮IIA治療，連續給藥7天后，大鼠的熱痛閾值和機械痛閾值明顯提高，我們初步證實：丹參酮IIA在化療誘導的神經病理性疼痛中發揮重要作用；并且發現連續丹參酮IIA治療7天，不僅產生穩定的抗痛敏效應，同時尚未發生類似阿片類藥物長期治療產生的鎮痛耐受。最近研究顯示：丹參酮IIA通過抑制膠質細胞活化和免疫反應，削弱脊神經結扎大鼠機械痛敏和熱痛敏，但是丹參酮IIA是否通過抑制膠質細胞活化在化療誘導的神經病理性疼痛模型中發揮抗痛敏效應？Westem blotting結果顯示：在丹參酮IIA治療7天后，化療痛大鼠脊髓星型膠質細胞標志物GFAP蛋白表達顯著升高，小膠質細胞標志物OX42蛋白表達在不同組之間變化一致；而丹參酮IIA各劑量組大鼠脊髓GFAP蛋白表達明顯少于化療痛組。已有研究表明：小膠質細胞激活在神經病性疼痛的形成期發揮作用；而星型膠質細胞激活在在神經病性疼痛的維持期發揮作用，本研究時間段恰恰是長春新堿誘導的神經病理性疼痛的維持期，因此，很可能在本實驗模型中，我們研究時間段小膠質細胞沒有被激活，星型膠質細胞激活占主導，導致對照組、化療痛組、Tanshinone IIA 10 mg/kg組、Tanshinone IIA 20 mg/kg組、Tanshinone IIA 50 mg/kg組大鼠脊髓OX42蛋白表達差異相當，但長春新堿誘導的神經病理性疼痛的形成期是否小膠質細胞被激活占優勢還有待于實驗進一步證實。

膠質細胞的激活促進炎癥因子TNF-α、IL-6等的合成和釋放，產生的促炎癥因子可參與興奮性氨基酸或其受體的調控，同時促炎癥因子還可介導神經突觸信號傳遞及影響神經纖維的電位時程，參與中樞敏化的形成。ELISA結果顯示，在使用丹參酮IIA治療7天后，化療痛組大鼠脊髓TNF-α、IL-6表達顯著升高，丹參酮IIA各劑量組脊髓TNF-α、IL-6蛋白表達明顯少于模型組，以上結合ELISA、Westem blotting結果推測：化療痛組大鼠脊髓TNF-α、IL-6表達顯著升高可能由激活星型膠質細胞合成和釋放TNF-α、IL-6增加，介導長春新堿誘導的痛敏形成，而Tanshinone IIA作用的靶點恰恰是激活星型膠質細胞，抑制TNF-α、IL-6合成和釋放，產生抗痛敏效應。但Tanshinone IIA是否通過抑制TNF-α、IL-6影響神經突觸信號傳遞及神經纖維的電位時程來發揮抗痛敏效應，還有待于實驗進一步證實。

總之，在本實驗條件下，丹參酮IIA能夠抑制長春新堿誘導的神經病理性疼痛，其作用的機制可能與其抑制大鼠脊髓星型膠質細胞活化，進而減少炎性細胞因子TNF-α，IL-6的表達相關。