載骨碎補(bǔ)總黃酮磷酸鈣骨水泥對(duì)骨缺損模型大鼠誘導(dǎo)膜中成骨細(xì)胞分化的影響及其機(jī)制研究Δ

董航，黃嘉華，麥喆钘，陳柏行，黃培鎮(zhèn)，蔡群斌，陳超，紀(jì)樹(shù)亮，孫偉鵬，黃尹瀅，周琦石#

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006）

骨缺損的治療是骨科手術(shù)治療中最困難的挑戰(zhàn)之一。既往研究表明，當(dāng)骨缺損的長(zhǎng)度大于骨內(nèi)直徑的2.5倍時(shí)，如果不采用手術(shù)治療干預(yù)，則骨缺損將難以通過(guò)自身修復(fù)[1］。目前，誘導(dǎo)膜（Masquelet）技術(shù)被認(rèn)為是一種治療骨缺損的有效手段，具有骨愈合時(shí)間短、技術(shù)要求低、并發(fā)癥少等特點(diǎn)；而且誘導(dǎo)膜在成骨過(guò)程中，可促進(jìn)機(jī)體分泌多種生長(zhǎng)因子，加快骨愈合[2］。該技術(shù)主要分為兩步:第一步是對(duì)骨缺損處進(jìn)行清創(chuàng)，將骨水泥置入缺損處進(jìn)行曠置，產(chǎn)生誘導(dǎo)膜；第二步是切開(kāi)誘導(dǎo)膜，移除骨水泥，在誘導(dǎo)膜內(nèi)填充足量的顆粒狀自體松質(zhì)骨[3］。

目前廣泛應(yīng)用于臨床的骨水泥是聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥，但由于其不能降解、缺乏生物活性等原因，常被其他材質(zhì)的骨水泥取代[4］。磷酸鈣骨水泥（CPC）由于具有性質(zhì)穩(wěn)定、可降解等特性，而且在低溫環(huán)境下能保持自身理化性質(zhì)穩(wěn)定，因此已被認(rèn)為是骨骼系統(tǒng)理想的藥物載體[5］。不過(guò)單一的CPC治療骨缺損效果欠佳，因此有學(xué)者嘗試通過(guò)改變誘導(dǎo)材料（即骨水泥成分）來(lái)改變誘導(dǎo)膜的生物活性，從而提高成骨效能、改善臨床療效[6］。聯(lián)合藥物的局部釋放可能是提高CPC治療效果的一種新方法，但加入何種藥物成分能增加誘導(dǎo)膜的成骨效能，目前報(bào)道甚少。已有研究發(fā)現(xiàn)，中藥對(duì)于促進(jìn)成骨具有良好療效[7-8］。本課題組在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可上調(diào)誘導(dǎo)膜中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，還能促進(jìn)骨缺損模型動(dòng)物的骨痂形成、提高其局部堿性磷酸酶（ALP）和人骨成型蛋白2（BMP-2）的含量，具有促進(jìn)成骨的作用[1］。姜自偉等[9］研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可通過(guò)提高局部BMP-2和Smad1的含量以促進(jìn)新骨形成、加快骨痂礦化和增強(qiáng)生物力學(xué)性能。但骨碎補(bǔ)總黃酮的局部釋放能否促進(jìn)誘導(dǎo)膜生物學(xué)特性的發(fā)揮、促進(jìn)骨的再生與修復(fù)，其作用機(jī)制又是什么?目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究。因此，本課題組采用載有骨碎補(bǔ)總黃酮的CPC干預(yù)治療骨缺損模型大鼠，觀察大鼠骨修復(fù)情況以及相關(guān)因子的變化，探索該載藥骨水泥對(duì)誘導(dǎo)膜成骨分化的影響及作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

FD-X型數(shù)字遙控X線機(jī)（中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供）；Eclipse CI型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；7500型化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國(guó)Beckman公司）；FluorChem Q型蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（美國(guó)Alpha公司）BT256型石蠟切片機(jī)（湖北闊海醫(yī)療科技有限公司）；12 cm手術(shù)用剪、10 cm眼用有齒鑷、微擺鋸（上海金鐘醫(yī)療手術(shù)器械廠）；不銹鋼六孔鋼板（課題組自制）；Secura型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；HW-60型孵化搖床（常州朗越儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

強(qiáng)骨膠囊（北京岐黃醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):20030007，規(guī)格:0.25 g；其有效成分為骨碎補(bǔ)總黃酮）；CPC、PMMA骨水泥（上海瑞邦生物技術(shù)公司；CPC由固相粉末和固化液兩部分組成，PMMA骨水泥由固劑和液劑兩部分組成）；兔抗人Smad1/4/7單克隆抗體、人抗兔BMP-2單克隆抗體、人抗兔VEGF單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔單克隆抗體（二抗）、甘油醛-3-硫酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；蘇木精-伊紅（HE）染料、二喹啉甲酸（BCA）測(cè)定試劑盒、電泳膠試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；RIPA裂解液（北京博凌科為生物科技有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒[愛(ài)必信（上海）生物技術(shù)有限公司］；硫酸慶大霉素注射液（廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司，規(guī)格:1 mL∶8×104U）；戊巴比妥（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度:＞99%）；氯化鈉注射液（四川美大康華康藥業(yè)有限公司，規(guī)格:500 mL∶4.5 g；作生理鹽水使用）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，2～3月齡，體質(zhì)量260～280 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提取，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK（粵）2013-0092。

2 方法

2.1 載藥/未載藥骨水泥的制備

2.1.1 載骨碎補(bǔ)總黃酮/未載藥CPC 在20℃環(huán)境溫度下，取CPC的固相粉末、固化液和骨碎補(bǔ)總黃酮溶液（取強(qiáng)骨膠囊內(nèi)容物，以生理鹽水為溶劑，按0.1 mg∶10 mL的比例配制成溶液，下同），按2∶1∶10（g/mL/mg）的比例放入50 mL注射器中混合成糊狀，灌注入直通型無(wú)菌吸痰管中固化20 min，制成載骨碎補(bǔ)總黃酮CPC（以下簡(jiǎn)稱為“載藥CPC”）。另以等體積生理鹽水代替骨碎補(bǔ)總黃酮溶液，同法制備未載藥CPC。兩者均于121℃消毒20 min，保存，備用[10］。

2.1.2 載骨碎補(bǔ)總黃酮/未載藥PMMA骨水泥 在20℃環(huán)境溫度下，取PMMA骨水泥的固劑、液劑和骨碎補(bǔ)總黃酮溶液，按2∶1∶10（g/g/mg）的比例放入50 mL注射器中混合成糊狀，灌注入直通型無(wú)菌吸痰管中固化5 min，制成載骨碎補(bǔ)總黃酮PMMA骨水泥（以下簡(jiǎn)稱為“載藥PMMA骨水泥”）。另以等體積生理鹽水代替骨碎補(bǔ)總黃酮溶液，同法制備未載藥PMMA骨水泥。兩者均于121 ℃消毒20 min，保存，備用[10］。

2.2 大鼠分組、造模與干預(yù)治療

取64只大鼠，隨機(jī)分為載藥CPC組、載藥PMMA骨水泥組、未載藥CPC組、未載藥PMMA骨水泥組，每組16只。各組大鼠以2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，在無(wú)菌條件下于其右側(cè)股骨處作3 cm縱向外側(cè)切口，分離并顯露股骨，取中段用微擺鋸行4 mm截骨并行鋼板固定，以建立大鼠骨缺損模型。各組大鼠分別在骨缺損部位植入相應(yīng)骨水泥適量，然后縫合周?chē)浗M織及皮膚切口。4周后，各組大鼠同法麻醉，切除部分尾巴，取下適量皮質(zhì)骨及松質(zhì)骨，剪成顆粒狀，作為自體松質(zhì)骨備用；在原股骨切口處依次切開(kāi)皮膚及皮下組織，切開(kāi)并保護(hù)好誘導(dǎo)膜，取出骨水泥，植入顆粒狀自體松質(zhì)骨，再依次縫合誘導(dǎo)膜、皮下及皮膚組織。每次術(shù)后均對(duì)大鼠肌內(nèi)注射慶大霉素8×104U，qd，連續(xù)3 d，以防止術(shù)后感染。

2.3 大鼠骨缺損區(qū)誘導(dǎo)膜形成情況觀察

造模后第4周，對(duì)各組大鼠后肢骨進(jìn)行X射線拍片，以觀察其骨缺損區(qū)的骨水泥材料降解、誘導(dǎo)膜形成及新生骨組織形成等情況。

2.4 大鼠骨缺損區(qū)誘導(dǎo)膜及新生骨組織形態(tài)學(xué)觀察

術(shù)后觀察大鼠飲食、活動(dòng)及傷口情況。各組大鼠分別于造模后第4周和植入自體松質(zhì)骨后第6周時(shí)各取8只大鼠取材，獲取造模后第4周時(shí)的誘導(dǎo)膜組織和植骨后第6周時(shí)的骨缺損區(qū)域周?chē)律? cm。將誘導(dǎo)膜組織和新生骨以10%福爾馬林固定24 h，經(jīng)脫鈣（誘導(dǎo)膜不作脫鈣處理）、乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后，行HE染色。在顯微鏡下觀察誘導(dǎo)膜的組織形態(tài)學(xué)變化；采用顯微測(cè)微尺測(cè)量并計(jì)算新生骨的骨小梁寬度，并采用Image J 1.46r軟件計(jì)數(shù)100倍視野范圍內(nèi)的成骨細(xì)胞個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 大鼠骨缺損區(qū)誘導(dǎo)膜中BMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)

采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.4”項(xiàng)下大鼠誘導(dǎo)膜組織的石蠟切片，脫蠟至水，室溫下使用3%H2O2處理5 min；水洗滌，37℃下以羊血清封閉10 min。分別加入BMP-2、VEGF抗體（稀釋度均為1∶1 000），37℃孵育1 h；水洗滌，加入二抗（稀釋度為1∶3 000），37℃孵育30 min；加入DAB顯色劑反應(yīng)5 min，水洗滌，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察陽(yáng)性染色情況。以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)棕黃色或棕紅色時(shí)定為目的蛋白陽(yáng)性染色，無(wú)上述染色現(xiàn)象者為陰性[10］；采用Image J 1.46r軟件進(jìn)行圖像分析，以灰度值表示目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 大鼠骨缺損區(qū)新生骨組織中Smad1、Smad4、Smad7蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blotting法進(jìn)行檢測(cè)。取“2.4”項(xiàng)下取材的新生骨組織，采用全蛋白提取液（RIPA裂解液-蛋白磷酸酶抑制劑混合物-蛋白酶抑制劑混合物-苯甲基磺酰氯的體積比為100∶1∶1∶1）提取其全蛋白，并采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白以組織裂解液稀釋至相同濃度后，加入5×Loading buffer上樣緩沖液，100℃水浴10 min，在－80℃條件下保存，備用。分別采用濃縮膠和分離膠進(jìn)行蛋白電泳，300 mA轉(zhuǎn)膜28～60 min，5%脫脂奶粉封閉1 h。將PVDF膜分別放入Smad1、Smad4、Smad7抗體稀釋液（稀釋度均為1∶1 000）中，4℃孵育過(guò)夜；次日以TBST緩沖液洗滌PVDF膜5 min×4次，然后將PVDF膜放入二抗稀釋液（稀釋度為1∶3 000）中，室溫下以搖床平緩搖動(dòng)孵育1 h；以TBST緩沖液洗滌PVDF膜5 min×4次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。采用蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，采用Image J 1.46r軟件進(jìn)行圖像分析，以GADPH為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)灰度值，用來(lái)表示蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠骨缺損區(qū)誘導(dǎo)膜形成情況

X射線檢查結(jié)果顯示，造模后第4周時(shí)，載藥CPC組大鼠骨缺損區(qū)的骨水泥大部分降解，呈模糊、絮狀影，周?chē)梢?jiàn)膜狀誘導(dǎo)膜組織形成，骨缺損區(qū)域相較于其余組更?。惠d藥PMMA骨水泥組大鼠骨缺損區(qū)骨水泥部分降解，但仍呈高密度影，界限較模糊，周?chē)梢?jiàn)膜狀誘導(dǎo)膜組織形成；未載藥CPC組、未載藥PMMA骨水泥組大鼠骨缺損區(qū)的骨水泥均未見(jiàn)明顯降解，仍呈高密度影，界限較為清晰。各組大鼠后肢骨區(qū)X射線檢查圖見(jiàn)圖1（注:圖中箭頭處為大鼠骨缺損區(qū)）。

3.2 各組大鼠骨缺損區(qū)誘導(dǎo)膜和新生骨的組織形態(tài)學(xué)

鏡下觀察可見(jiàn)，造模后第4周時(shí)，載藥CPC組大鼠誘導(dǎo)膜中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞豐富，排列有序，形成豐富毛細(xì)血管網(wǎng)的趨勢(shì)較其余組更明顯；載藥PMMA骨水泥組大鼠誘導(dǎo)膜中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生較多，排列有序性不明顯；未載藥CPC組大鼠誘導(dǎo)膜中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生較多，但分化未成熟、排列紊亂；未載藥PMMA骨水泥組大鼠誘導(dǎo)膜中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生不明顯，且分化未成熟、排列紊亂。植骨后第6周時(shí)，各組大鼠新生骨的骨小梁寬度和成骨細(xì)胞數(shù)均顯著增加；與載藥PMMA骨水泥組、未載藥CPC組、未載藥PMMA骨水泥組分別比較，載藥CPC組大鼠新生骨的骨小梁寬度和成骨細(xì)胞數(shù)均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠骨缺損區(qū)誘導(dǎo)膜組織形態(tài)學(xué)顯微圖見(jiàn)圖2，骨缺損區(qū)新生骨指標(biāo)水平見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠后肢骨區(qū)X射線檢查圖Fig 1 X-raymapofhindlimbboneareaofratsineachgroup

圖2 各組大鼠骨缺損區(qū)誘導(dǎo)膜組織形態(tài)學(xué)顯微圖（HE染色，×100）Fig 2 Histomorphological micrographs of induced membranes in bone defect areas of rats in each group（HE staining，×100）

3.3 各組大鼠骨缺損區(qū)誘導(dǎo)膜中BMP-2、VEGF的蛋白表達(dá)水平

鏡下觀察可見(jiàn)，造模后第4周時(shí)，各組大鼠誘導(dǎo)膜中BMP-2、VEGF蛋白染色均勻，細(xì)胞核明顯。其中，載藥CPC組陽(yáng)性染色區(qū)域大且染色程度深，陽(yáng)性和陰性染色區(qū)域區(qū)分明顯；載藥PMMA骨水泥組陽(yáng)性染色區(qū)域較大但較載藥CPC組小，染色程度較深，陽(yáng)性和陰性染色區(qū)域區(qū)分明顯；未載藥CPC組陽(yáng)性染色區(qū)域較小且染色程度較淺，但仍可區(qū)分陽(yáng)性和陰性染色區(qū)域；未載藥PMMA骨水泥組陽(yáng)性染色區(qū)域極小且染色程度極淺，陽(yáng)性和陰性染色區(qū)域邊界較模糊。VEGF蛋白染色后鏡下觀察結(jié)果與BMP-2蛋白觀察結(jié)果類似。定量分析結(jié)果顯示，與載藥PMMA骨水泥組、未載藥CPC組、未載藥PMMA骨水泥組分別比較，載藥CPC組大鼠誘導(dǎo)膜中BMP-2、VEGF的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠誘導(dǎo)膜中BMP-2、VEGF蛋白陽(yáng)性染色顯微圖見(jiàn)圖3、圖4（圖中，粗箭頭為藍(lán)染細(xì)胞核，細(xì)箭頭為棕色陽(yáng)性染色），蛋白表達(dá)水平見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠骨缺損區(qū)新生骨指標(biāo)水平（x±s，n＝8）Tab 1 The level of new bone indexes in bone defect area of rats in each group（x±s，n＝8）

圖3 各組大鼠誘導(dǎo)膜中BMP-2蛋白陽(yáng)性染色顯微圖（×200）Fig 3 Micrographs of BMP-2 protein positive stai-ning in the induced membranes of rats in each group（×200）

3.4 各組大鼠骨缺損區(qū)新生骨組織中Smad1、Smad4、Smad7的蛋白表達(dá)水平

鏡下觀察可見(jiàn)，植骨后第6周時(shí)，與載藥PMMA骨水泥組、未載藥CPC組、未載藥PMMA骨水泥組分別比較，載藥CPC組大鼠新生骨組織中Smad1、Smad4、Smad7的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠骨缺損區(qū)新生骨組織中Smad1、Smad4、Smad7蛋白電泳圖見(jiàn)圖5，蛋白表達(dá)水平見(jiàn)表3。

圖4 各組大鼠誘導(dǎo)膜中VEGF蛋白陽(yáng)性染色顯微圖（×200）Fig 4 Micrographs of VEGF protein positive staining in the induced membranes of rats in each group（×200）

表2 各組大鼠誘導(dǎo)膜中BMP-2、VEGF的蛋白表達(dá)水平（x±s，n＝8）Tab 2 Protein expression of BMP-2 and VEGF in the induced membranes of rats in each group（x±s，n＝8）

圖5 各組大鼠骨缺損區(qū)新生骨組織中Smad1、Smad4、Smad7蛋白電泳圖Fig 5 Electrophoregrams of Smad1，Smad4 and Smad7 proteins in new bone tissues of bone defect areas of rats in each group

4 討論

CPC作為一種新型非陶瓷型羥基磷灰石類人工骨材料，在體內(nèi)可生物降解，并能被新生骨以爬行方式代替；其機(jī)械強(qiáng)度較松質(zhì)骨強(qiáng)，而彈性模量與皮質(zhì)骨相仿，具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性和多孔性等特點(diǎn)，加之其無(wú)毒、無(wú)刺激性的優(yōu)點(diǎn)，使之成為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的理想場(chǎng)所[11］。CPC不僅可作為骨缺損的填充物，還可作為藥物的載體，實(shí)現(xiàn)藥物的局部緩釋[12］，并在一段時(shí)間內(nèi)維持局部藥物濃度處于高水平[13］，達(dá)到治療與修復(fù)骨損傷的目的。中藥骨碎補(bǔ)具有活血續(xù)傷、補(bǔ)腎強(qiáng)骨的作用，是治療跌撲損傷、筋斷骨折的要藥，可促進(jìn)誘導(dǎo)膜內(nèi)血管的形成[1］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補(bǔ)總黃酮可下調(diào)滑膜組織及軟骨組織/細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）和VEGF的表達(dá)，從而減輕膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔滑膜和軟骨組織的損傷[14］；在兔股骨缺損模型中植入含骨碎補(bǔ)總黃酮的CPC支架后，在骨缺損修復(fù)區(qū)周?chē)梢?jiàn)新骨生成，并隨著時(shí)間推移而逐漸成熟，新生骨小梁從缺損邊緣向內(nèi)部生長(zhǎng)，成骨逐漸成形[15］。但載骨碎補(bǔ)總黃酮CPC促進(jìn)骨損傷愈合的具體機(jī)制仍未闡明，因此本研究重點(diǎn)考察了該骨水泥對(duì)誘導(dǎo)膜骨分化的影響，旨在探索其促進(jìn)骨愈合的相關(guān)機(jī)制。

表3 各組大鼠骨缺損區(qū)新生骨組織中Smad1、Smad4、Smad7的蛋白表達(dá)水平（x±s，n＝8）Tab 3 Expression levels of Smad1，Smad4 and Smad7 in new bone tissue of bone defect areas of rats in each group（x±s，n＝8）

骨修復(fù)主要由成骨細(xì)胞來(lái)完成，成骨細(xì)胞的有效增殖可促進(jìn)骨重建[16］。本研究采用X射線檢查后發(fā)現(xiàn)，載藥CPC對(duì)于促進(jìn)大鼠骨缺損修復(fù)的效率高于未載藥CPC，載藥PMMA骨水泥對(duì)骨缺損修復(fù)效率亦高于未載藥PMMA骨水泥，這說(shuō)明骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)于骨修復(fù)具有積極的促進(jìn)作用。同時(shí)，載藥CPC對(duì)骨缺損修復(fù)效率高于載藥PMMA骨水泥，未載藥CPC對(duì)骨缺損修復(fù)效率亦高于未載藥PMMA骨水泥，這說(shuō)明CPC在骨修復(fù)方面的效果優(yōu)于PMMA骨水泥，與已有研究[4-5］結(jié)果吻合。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，各組大鼠骨缺損區(qū)的骨水泥材料均未完全降解，這可能與本實(shí)驗(yàn)周期較短，骨水泥材料沒(méi)有充足的降解時(shí)間有關(guān)。但載藥CPC的降解速度明顯快于未載藥CPC，這可能是由于骨碎補(bǔ)總黃酮能促進(jìn)誘導(dǎo)膜形成，誘導(dǎo)膜產(chǎn)生的某種因子加快了CPC的降解，但具體原因仍待相關(guān)研究確證。

新生血管的形成和成骨密切相關(guān)，誘導(dǎo)膜組織的形成可促進(jìn)骨缺損創(chuàng)口愈合[17］。本研究結(jié)果顯示，載藥CPC組大鼠誘導(dǎo)膜組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞較其余3組更成熟；在植骨6周后，載藥CPC組大鼠新生骨組織中的骨小梁寬度和成骨細(xì)胞數(shù)亦較其余3組顯著增加。這提示其能刺激誘導(dǎo)膜中的血管新生，進(jìn)而促進(jìn)骨損傷修復(fù)。

經(jīng)典成骨信號(hào)通路BMP/Smads通路中，BMP屬于TGF-β超家族成員，可發(fā)揮促胚胎發(fā)育、軟骨內(nèi)骨形成和骨骼生長(zhǎng)、重建、再生作用[18］。BMP-2與多種細(xì)胞因子形成BMP-2信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟，并誘導(dǎo)骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌[19］。Smads家族是TGF-β超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的胞漿遞質(zhì)，同時(shí)也是BMP信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，BMP激活Smad蛋白，可將轉(zhuǎn)化TGF-β信號(hào)直接由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，Smad1的激活具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用[20］；Smad4可調(diào)節(jié)BMP-2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物參與成骨細(xì)胞分化，同時(shí)與BMP-2復(fù)合體產(chǎn)生相互協(xié)調(diào)作用，從而應(yīng)答成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[21］；Smad7可傳導(dǎo)抑制性信號(hào)，抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化[22］，但也有學(xué)者認(rèn)為Smad7的表達(dá)對(duì)于成骨過(guò)程有一定的促進(jìn)作用[23］。本研究結(jié)果顯示，載藥CPC干預(yù)治療后大鼠骨缺損區(qū)新生骨細(xì)胞中BMP-2、Smad1、Smad4、Smad7蛋白均呈高表達(dá)，提示骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過(guò)激活BMP/Smads通路來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟，加快骨缺損的修復(fù)。

VEGF是一類促血管生成因子，具有較強(qiáng)的促進(jìn)血管內(nèi)皮增生和新血管形成的生物學(xué)功能，其在骨組織中的表達(dá)增高有利于骨組織內(nèi)新血管形成，可促進(jìn)新生骨的形成[24］。本研究結(jié)果顯示，載藥CPC組大鼠新生骨組織中VEGF蛋白呈高表達(dá)，提示骨碎補(bǔ)總黃酮可能通過(guò)提高骨細(xì)胞中的VEGF蛋白表達(dá)，加快毛細(xì)血管網(wǎng)的新生和成骨細(xì)胞的分化，從而加快骨缺損的修復(fù)。

綜上所述，載骨碎補(bǔ)總黃酮CPC具有促進(jìn)誘導(dǎo)膜成骨的作用，這可能是通過(guò)激活BMP-2/Smad通路，從而調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化；同時(shí)，其可通過(guò)提高VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，加快形成毛細(xì)血管網(wǎng)，從而促進(jìn)骨愈合。但高表達(dá)的Smad7在骨愈合中具體是發(fā)揮促進(jìn)還是抑制作用，或者說(shuō)其生物作用與表達(dá)量相關(guān)，又是否存在雙向調(diào)節(jié)作用？為此，課題組后續(xù)擬進(jìn)一步研究探索Smad7與成骨過(guò)程之間的調(diào)控關(guān)系，深入揭示骨碎補(bǔ)總黃酮促骨損傷修復(fù)的分子機(jī)制。