女金丸HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析Δ

林林，于鳳蕊，徐麗華，林永強

（山東省食品藥品檢驗研究院，濟南250101）

女金丸是在明《景岳全書》第六十一卷女金丹方基礎上加減而成，由當歸、白芍、黨參、牡丹皮、黃芩等23味中藥組成。其中，當歸養血調經，黨參補脾益氣，為君藥；白芍、熟地、阿膠養血和血，為臣藥；川芎入血而理氣，為佐藥；甘草益氣調藥，為使藥。另外，白術、茯苓健脾化濕；香附、陳皮疏肝理氣；肉桂、鹿角霜補火助陽；益母草、丹皮、沒藥、延胡索活血涼血，化瘀止痛；藁本、白芷祛風止痛；黃芩、白薇清虛熱；赤石脂收斂固澀，可止離經之血；砂仁化濕行氣；全方配伍，具有調經養血、理氣活血、止痛之功效。該方為臨床常用婦科用藥，收載于國家基本藥物目錄，其現行標準收載于2015年版《中國藥典》（一部），但僅采用單一藥味的顯微及薄層色譜鑒別以及橙皮苷的含量測定來控制產品的質量[1］，無法全面反映產品的質量。鑒于此，筆者通過檢測10批女金丸樣品，建立其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結合聚類分析、主成分分析對其質量進行評價，旨在為女金丸的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2996型二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站（美國Waters公司）；AE240型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司］；Milli-QAcademic型超純水器（美國Millipore公司）；SX-120DT型超聲波清洗機（上海圣訓儀器有限公司）；HH-2型數顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；FW100型高速萬能粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

女金丸10批，包括山東宏濟堂制藥集團股份有限公司（委托加工參比樣品，批號:2017ZZ1，編號:S1）、包頭中藥有限責任公司（批號:A15117，編號:S2）、北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠（批號:3013360，編號:S3）、哈藥集團世一堂制藥廠（批號:1503105，編號:S4）、昆明中藥廠有限公司（批號:510161，編號:S5）、內蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司（批號:11140515，編號:S6）、山西華康藥業股份有限公司（批號:20150601，編號:S7）、山西振東開元制藥有限公司（批號:20170401，編號:S8）、同藥集團大同制藥有限公司（批號:20150816，編號:S9）、藥都制藥集團股份有限公司（批號:150101，編號:S10），規格均為9 g/丸，橙皮苷含量不得低于8.0 mg。芍藥苷對照品（批號:110736-201741，純度:95.7%）、甘草苷對照品（批號:111610-201106，純度:93.7%）、阿魏酸對照品（批號:110773-201614，純度:99.0%）、橙皮苷對照品（批號:110721-201115，純度:95.3%）、黃芩苷對照品（批號:110715-201117，純度:91.7%）、漢黃芩苷對照品（批號:112002-201702，純度:98.5%）、黃芩素對照品（批號:111595-200905，純度:98.5%）、丹皮酚對照品（批號:110708-201407，純度:99.9%）、桂皮醛對照品（批號:110710-201720，純度:98.7%）、甘草酸銨對照品（批號:110731-201418，純度:93.1%）、漢黃芩素對照品（批號:111514-201304，純度:100%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；蕓香柚皮苷對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號:MUST-17030408，純度:99.2%）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色 譜 柱 :Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，10%A→35%A；25～37 min，35%A→59%A；37～40 min，59%A→75%A）；采用波長切換技術（0～20 min:230 nm，測定芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、橙皮苷；20～40 min:270 nm，測定黃芩苷、漢黃芩苷、桂皮醛、黃芩素、丹皮酚、甘草酸銨、漢黃芩素）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量:10 μL。理論板數以黃芩苷峰計不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、蕓香柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷、桂皮醛、黃芩素、丹皮酚、甘草酸銨和漢黃芩素對照品適量，分別置于25 mL量瓶中，加90%甲醇制得質量濃度分別為106.2、23.7、25.9、64.1、292.5、333.9、83.4、25.8、77.2、82.4、72.4、53.9 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取女金丸樣品9 g，精密稱定，精密加入硅藻土4.5 g，混勻，研細，再精密稱取上述混合物3 g，置于100 mL量瓶中，精密加入90%甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用90%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 將女金丸供試品溶液（編號:S1）連續進樣6次，記錄各主要峰的相對峰面積和相對保留時間。結果，以黃芩苷為參照峰，21個特征峰相對峰面積RSD值為0.12%～1.64%，相對保留時間的RSD值為0.14%～0.62%，表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取同一女金丸供試品溶液（編號:S1），分別于室溫下放置0、3、6、9、15、18、24 h進樣分析，記錄各主要峰的相對峰面積和相對保留時間。結果，以黃芩苷為參照峰，21個特征峰相對峰面積RSD值為0.47%～1.74%，相對保留時間的RSD值為0.21%～0.74%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定。

2.3.3 重復性試驗 取同一批女金丸樣品（編號:S1），按“2.2.2”項下方法平行制備6份，進樣分析，記錄各主要峰的相對峰面積和相對保留時間。結果，以黃芩苷為參照峰，21個特征峰相對峰面積RSD值為0.51%～1.49%，相對保留時間的RSD值為0.17%～0.68%，表明方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜的建立及相似度評價 取10批女金丸樣品（S1～S10），按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，將得到的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）》，以S1為參考圖譜，時間窗寬度設為0.3 min，自動匹配10批指紋圖譜（采用多點校正），建立女金丸HPLC指紋圖譜的共有模式（平均值法）。根據匹配結果確定21個共有峰，并生成對照指紋圖譜，計算出各批次樣品的指紋圖譜相似度均大于0.95。在所有共有峰中，11號峰位置居中，分離度及對稱性均良好，確定為參照峰（S）。相對保留時間、相對峰面積和相似度測定結果分別見表1～表3。S1～S10指紋圖譜疊加圖譜、對照指紋圖譜以及對照品圖譜分別見圖1～圖3。

2.4.2 指紋圖譜中共有峰指認 通過與對照品圖譜（圖3）比對可以指認其中的12個色譜峰，分別是芍藥苷（2號峰）、甘草苷（4號峰）、阿魏酸（5號峰）、蕓香柚皮苷（6號峰）、橙皮苷（7號峰）、黃芩苷（11號峰）、漢黃芩苷（14號峰）、桂皮醛（15號峰）、黃芩素（16號峰）、丹皮酚（17號峰）、甘草酸銨（18號峰）和漢黃芩素（19號峰）。

表1 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 1 Relative retention time of common peaks for 10 batches of Nüjin pills

表2 10批樣品HPLC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 2 Relative peak areas of common peaks for 10 batches of Nüjin pills

2.5 聚類分析

以10批樣品的21個共有峰的相對峰面積為原始數據，采用SPSS 22.0軟件，以系統聚類法結合歐氏距離（d）為測度進行分析，結果見圖4。由圖4可知，d＝25時，10批樣品可聚為2類，S3為一類，其余聚為一類；d＝5時，后一類又可聚為3類，即S2、S4、S6、S10聚為一類，S5、S9聚為一類，S1、S7、S8聚為一類。

表3 10批樣品相似度Tab 3 Similarity of 10 batches of Nüjin pills

圖1 10批樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superimposed fingerprint of 10 batches of Nüjin pills

圖2 女金丸的HPLC對照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of Nüjin pills

2.6 主成分分析

以各共有峰的相對峰面積為指標，將10批女金丸21個共有峰的相對峰面積進行標準化處理后，采用SPSS 22.0軟件進行主成分分析，計算其特征值和方差貢獻率，以特征值＞1為標準，得到前3個主成分因子的特征值分別為10.642、1.984、1.061，是影響女金丸質量評價的主要因子；3個主成分因子的累積方差貢獻率為90.642%，結果見表4。選擇提取該3個主成分因子對10批女金丸樣品進行評分，以方差貢獻率為分配系數，線性組合2個主成分因子，計算各批樣品的主成分因子得分及綜合得分，并對綜合得分進行排序，結果見表5（綜越高表明對女金丸樣品中有效成分的統計質量越好[2-3］）。由表5可知，綜合得分由高到低依次為S3、S5、S10、S9、S4、S8、S2、S6、S1、S7。

圖3 對照品HPLC圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of substance control

圖4 10批樣品聚類分析樹狀圖Fig 4 Dendrogram of cluster analysis for 10 batches of Nüjin pills

表4 3個主成分因子的特征值和方差貢獻率Tab 4 Eigenvalue and variance contribution rate of 3 main component factors

表5 10批樣品主成分因子得分及排序Tab 5 Factor scores and sorting of principal components for 10 batches of samples

3 討論

中藥指紋圖譜是一種多指標質量控制模式，可通過表征中藥復雜成分及其內在質量的關系來較全面地反映所含化學成分的種類和數量，從而反映藥品的質量，在中藥制劑的質量評價中應用廣泛[4-7］。

本研究在制備女金丸HPLC供試品溶液時，曾分別采用超聲、加熱回流兩種方式，并對50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇等提取溶劑進行篩選[8-12］。結果顯示，不同提取方法所得供試品溶液的色譜行為接近，但是部分色譜峰響應值存在較為明顯的差異，綜合21個共有峰的響應情況，最終選擇90%甲醇加熱回流1 h進行提取。本研究前期分別考察甲醇-水、乙腈-水系統的分離效果，結果相較于甲醇-水系統，乙腈-水系統梯度洗脫過程中基線更為平穩，分離效果較好。此外，為了改善峰形、提高分離度，本研究前期還考察了在水相中分別添加0.1%、0.2%、0.4%甲酸的效果，結果在各種酸度條件下色譜行為無明顯差異，最終選擇乙腈-0.2%甲酸溶液為流動相。在測定波長的選擇中，采用二極管陣列檢測器在190～400 nm波長范圍內進行掃描，發現在270 nm波長處，各色譜峰響應較好，因此選擇270 nm作為檢測波長。

本研究所建立的女金丸HPLC指紋圖譜，可反映女金丸的整體性和特異性信息。在21個共有峰中，通過與對照品HPLC圖譜比對指認出了12個成分。10批樣品的相似度評價結果表明，各批藥材樣品間質量存在差異。各共有峰相對保留時間的RSD差異小，但相對峰面積的RSD相差較大，提示不同廠家的女金丸樣品的成分雖一致，但含量存在差異，提示不同企業的投料藥材質量存在差異。

綜上所述，所建立的HPLC指紋圖譜及聚類分析和主成分分析結果可為女金丸的質量控制和評價提供參考。