左氧氟沙星片及胃漂浮緩釋微丸在大鼠體內的藥動學比較研究Δ

邱妍川，鐘玲，何靜

（1.重慶醫藥高等專科學校藥學院，重慶401331；2.重慶藥友制藥有限責任公司研發中心，重慶 401121）

左氧氟沙星（Levofloxacin）作為第三代喹諾酮類抗菌藥物，被中華醫學會消化病學分會確認為幽門螺桿菌感染初次及補救治療方案首選藥物，療效肯定，是目前臨床上用于治療消化性潰瘍的主要藥物之一[1-2］。該藥市售口服劑型以片劑、膠囊劑為主，但上述劑型在胃、小腸上部無菌部位的停留時間有限，即便將其制備為普通緩釋制劑，也難以確保其在胃腸道有充足的釋藥時間，故其治療效果受到明顯影響[3-4］。

胃漂浮緩釋微丸可在胃內持續漂浮，延長藥物的胃內滯留時間，促使其在作用部位充分釋放，有助于提高藥物的口服生物利用度，同時克服了胃漂浮片等單元系統可能出現的突釋現象，備受研究人員的廣泛關注[5-7］。將左氧氟沙星制成胃漂浮緩釋微丸可使藥物與幽門螺桿菌充分接觸，在發揮殺菌作用的同時，可有效促進藥物在小腸上部的吸收，有助于穩定其血藥濃度、減少患者服藥次數、提高臨床療效[8-9］。本課題組在前期制備左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸的基礎上，建立了檢測大鼠血漿中左氧氟沙星濃度的超高效液相色譜法（UPLC），并比較了左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸與普遍片劑在大鼠體內的藥動學差異，旨在為左氧氟沙星新型口服制劑的設計與制備提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1290型UPLC儀，配有含60 mm高靈敏度最大光強卡套式流通池的二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；XS205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Vortex Genius 3型渦漩混合儀（德國IKA公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；Allegra X-22R Centrifuge型多功能臺式高速低溫離心機（美國Beckman公司）；KQ-500E型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；E-50型擠出滾圓機、WBF型流化床包衣機（重慶英格造粒包衣技術有限公司）。

1.2 藥品與試劑

左氧氟沙星原料藥（浙江國邦藥業有限公司，批號:160809，純度:＞99%）；左氧氟沙星對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:130455-201607，純度:供含量測定用）；左氧氟沙星片[參比制劑，第一三共制藥（北京）有限公司，批號:1704G16，規格:0.5 g］；微晶纖維素（MCC，杭州高成生物營養技術公司，批號:20170101）；羥丙基甲基纖維素[HPMC，陶氏化學（中國）有限公司，批號:3A290124L1］；Eudragit?RL-30D 丙烯酸樹脂（德 國ROHM公司，批號:G140916556）；碳酸氫鈉（重慶川江化學試劑廠，批號:20161102）；檸檬酸三乙酯（濰坊迪蒙化工有限公司，批號:161126）；聚乙二醇400（PEG400，湖南爾康制藥股份有限公司，批號:20160601）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制去離子水。

1.3 動物

清潔級SD大鼠，雌雄各半，6周齡，體質量（162±25）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供[動物使用許可證號:SYXK（渝）2017-0023］。

2 方法與結果

2.1 左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸的制備

將左氧氟沙星原料藥、十六醇、MCC按質量比7∶26∶6混合后，過100目篩，加60%乙醇適量制備軟材，用擠出滾圓機于0.7 mm篩孔擠出滾圓制粒，于40℃干燥，得丸芯；將起泡劑碳氫酸鈉、黏合劑HPMC、水溶性增塑劑PEG400按質量比6∶2∶1（g/g/g）配制產氣包衣液，將Eudragit?RL-30D丙烯酸樹脂、檸檬酸三乙酯按質量比6∶1（g/g）配制阻滯包衣液，采用流化床包衣機將丸芯與包衣液混合，制得左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸，平均載藥量12.3%（質量比）。

2.2 分組與給藥

將大鼠按隨機數字法分成兩組，即左氧氟沙星片組和左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸組，每組6只。所有大鼠均禁食、不禁水12 h，于次日晨起分別空腹灌胃左氧氟沙星片和“2.1”項下左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸40 mg/kg[均按左氧氟沙星質量計，以生理鹽水為溶劑；劑量按成人與大鼠換算系數（0.018）計算而得］。

2.3 血漿樣品采集

分別于給藥前及給藥后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h自眼眶取血0.3 mL，置于肝素化的塑料離心管中，以5 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于－20℃冰箱中保存，備用。

2.4 色譜條件

色譜柱:Waters Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），保護柱:BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相:0.1%甲酸溶液-乙腈（78∶22，V/V）；流速:0.3 mL/min；檢測波長:294 nm；柱溫:40 ℃；進樣量:2 μL。

2.5 溶液的制備

精密稱取左氧氟沙星對照品20.12 mg，置于100 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲（功率:500 w，頻率:40 kHz）1 min使溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.201 mg/mL的對照品貯備液。

2.6 血漿樣品的處理

精密量取大鼠血漿樣品100 μL，置于0.5 mL EP管中，加入甲醇300 μL，渦旋混勻1 min，于10℃下以12 000 r/min離心5 min，取上清液適量，進樣分析。

2.7 方法學考察

2.7.1 專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿+左氧氟沙星對照品及大鼠灌胃后12 h時的血漿樣品（左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸組）各適量，按“2.6”項下方法處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（見圖1）。結果，左氧氟沙星的保留時間約為3.5 min，峰形較好，內源性物質不干擾左氧氟沙星的定量分析。

圖1 超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatograms

2.7.2 標準曲線的繪制與定量下限（LLOQ）、最低檢測限的考察 精密量取“2.5”項下對照品貯備液各適量，用空白大鼠血漿稀釋，制成質量濃度分別為0.20、0.50、1.01、5.03、10.06、20.12 μg/mL的含藥血漿樣品，按“2.6”項下方法處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以左氧氟沙星質量濃度（c，μg/mL）為橫坐標、左氧氟沙星峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝11.496 6c+2.106 1（r＝0.998 2）。結果，左氧氟沙星檢測血藥濃度的線性范圍為0.20～20.12 μg/mL。分別以信噪比10∶1、3∶1考察LLOQ和最低檢測限。結果，左氧氟沙星的LLOQ為0.20 μg/mL，最低檢測限為0.04 μg/mL。

2.7.3 精密度與方法回收率試驗 按“2.7.2”項下方法配制左氧氟沙星LLOQ（0.20 μg/mL）血漿樣品和低、中、高質量濃度（0.50、5.03、15.09 μg/mL）質控樣品各5份，按“2.6”項下方法處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣分析，考察日內精密度；連續測定3 d，考察日間精密度；以實測質量濃度與理論質量濃度進行比較，考察方法回收率。結果，左氧氟沙星LLOQ血漿樣品及低、中、高質量濃度質控樣品的日內RSD分別為5.79%、2.53%、3.47%、4.40%（n＝5），日間RSD分別為7.21%、5.69%、6.43%、6.25%（n＝15）；方法回收率分別為（96.27±6.21）%、（97.85±4.76）%、（97.26±5.23）%、（98.55±4.32）%，RSD分別為6.45%、4.86%、5.38%、4.38%（n＝5）。

2.7.4 提取回收率 按“2.7.2”項下方法配制左氧氟沙星LLOQ（0.20 μg/mL）血漿樣品和低、中、高質量濃度（0.50、5.03、15.09 μg/mL）質控樣品各5份，按“2.6”項下方法處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積（A1）。取“2.5”項下對照品貯備液適量，用甲醇稀釋至上述相應質量濃度，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積（A2），提取回收率＝A1/A2×100%。結果，左氧氟沙星LLOQ血漿樣品及低、中、高質量濃度質控樣品的提取回收率分別為（84.24±3.73）%、（84.31±3.02）%、（85.65±2.51）%、（86.34±2.76）%，RSD 分別為4.43%、3.58%、2.93%、3.20%（n＝5）。

2.7.5 穩定性考察 按“2.7.2”項下方法配制左氧氟沙星低、高質量濃度（0.50、15.09 μg/mL）質控樣品，分別于室溫放置12 h、－20℃放置12 d、凍融（－20℃～室溫）3次后，按“2.6”項下方法處理后，再按“2.4”項下色譜條件進樣測定，考察各樣品在上述條件下的穩定性，每質量濃度平行操作3次。結果，各樣品實測質量濃度與理論質量濃度的偏差在±15%之內，表明其在上述條件下穩定性良好。

2.8 藥動學研究

圖2 大鼠單劑量灌胃左氧氟沙星片和左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸的平均藥-時曲線Fig 2 Average drug concentration-time curves after single dose of Levofloxacin tablets and gastric floating sustained-release pellets in rats with intragastric administration

12只SD大鼠按“2.2”項下方法分組、給藥后，按“2.3”“2.6”項下方法采血并處理，再按“2.4”項下色譜條件進樣分析，根據隨行標準曲線計算左氧氟沙星的質量濃度，并采用Excel 2007軟件繪制平均藥-時曲線，詳見圖2。

采用DAS 3.0軟件處理上述平均藥-時曲線數據，計算兩種制劑的主要藥動學參數，并計算相對生物利用度[F＝（AUC0-t）微丸組/（AUC0-t）片劑組×100%］，結果見表1。采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析。數據以x±s表示，組間比較采用F檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

由圖2、表1可見，大鼠單劑量灌胃左氧氟沙星片和左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸后的平均藥-時曲線均符合二室模型。與左氧氟沙星片比較，其胃漂浮微丸的達峰濃度（cmax）顯著降低，達峰時間（tmax）、消除半衰期（t1/2β）、藥-時曲線下面積（AUC）、平均駐留時間（MRT）均顯著延長或升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而兩組表觀分布容積（V/F）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸的相對生物利用度為294%。

表1 大鼠單劑量灌胃左氧氟沙星片和左氧氟沙星胃漂浮緩釋微丸的主要藥動學參數（x±s，n＝6）Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after single dose of Levofloxacin tablets and gastric floating sustained-release pellets in rats with intragastric administration（x±s，n＝6）

3 討論

左氧氟沙星為抗菌力強、抗菌譜廣的喹諾酮類代表藥物。有研究人員對左氧氟沙星三聯療法治療幽門螺桿菌感染的效果進行評價，結果發現患者胃內較高濃度的左氧氟沙星能更容易地殺滅幽門螺桿菌[10］。由于其普通口服制劑在胃內滯留時間較短，導致藥物釋放不完全，或在胃腸道吸收區暴露不足，使得藥效受到影響[3-4，11］，因此延長藥物在胃內的滯留時間是提高左氧氟沙星治療消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病效果的方法之一。目前，雖有將其制備成為胃漂浮片的報道，但該劑型屬于單元系統，可能存在突釋現象使藥物濃度局部過高，或漂浮性能欠佳，導致胃排空快、釋藥不完全等現象的發生，從而影響治療效果[12］。而將左氧氟沙星制成胃漂浮緩釋微丸可避免單元系統可能出現的突釋現象；加之該種劑型的丸芯密度小，其產氣層的存在使制劑進入胃內后能產生二氧化碳，促使微丸在胃中停留更長時間，保證藥物釋放更為完全，以提升其治療胃部疾病的效果[5-7］。

現有文獻報道多采用高效液相色譜法（HPLC）、液質聯用法（LC-MS）測定生物樣品中左氧氟沙星的濃度，但檢測中多運用其他藥物（如谷氨酸洛美沙星、環丙沙星）作為內標，且耗時相對較長；雖有研究人員采用超快速液相色譜串聯質譜法（UFLC-MS/MS）進行含量測定，檢測時間有所縮短，但成本較高且操作煩瑣，不適用于大樣本的批量檢測[13-15］。UPLC法較普通HPLC法的成本略高，但其在檢測時間、靈敏度和試劑使用成本等方面均具有較大優勢。為此，本研究建立了檢測大鼠血漿中左氧氟沙星濃度的UPLC法。在前期預試驗中，本課題組評價了中性流動相（水-乙腈）的分離效果，發現左氧氟沙星的色譜峰峰形較差；而在水中加入0.1%甲酸后，左氧氟沙星的色譜峰峰形得到明顯改善。在篩選色譜柱時，本課題組選擇了UPLC BEH C18色譜柱，該色譜柱的酸堿耐受性較好，所得左氧氟沙星的色譜峰峰形對稱、峰寬較窄，且分離效率較高。在樣品的前處理方法優化過程中，本課題組同時比較了甲醇、乙腈、6%高氯酸溶液的沉淀效果。結果顯示，以甲醇作為沉淀劑可避免雜質峰對待測物的干擾，且操作簡便、快速。為提高檢測效率，本研究采用了外標法，經方法學驗證，本法精密度與回收率均符合2015年版《中國藥典》（四部）生物樣品定量分析的相關要求[16］，且操作、計算更為簡便；本法左氧氟沙星檢測血藥濃度的線性范圍為0.20～20.12 μg/mL，LLOQ 為 0.20 μg/mL，最低檢測限為 0.04 μg/mL，靈敏度較高，適用于大鼠血漿中左氧氟沙星的定量分析。

藥動學研究結果表明，制成胃漂浮緩釋微丸后，左氧氟沙星的tmax、t1/2β、AUC、MRT均較普通片劑顯著延長或升高，相對生物利用度是普通片劑的近3倍。左氧氟沙星普通片劑給藥12 h后，難以檢出血中藥物殘留；而胃漂浮緩釋微丸在給藥24 h后，仍能檢出藥物殘留，提示將左氧氟沙星制成胃漂浮緩釋微丸可明顯延長藥物在體內停留的時間，提高其生物利用度。這可能是由于劑型的改善使得藥物在胃內停留的時間明顯延長，使其釋放更完全；同時，該劑型又能使部分藥物通過幽門進入小腸，大大提高了藥物的吸收程度[5］。后續可通過檢測胃及腸道組織中的藥物濃度來進一步驗證。

綜上所述，本研究建立了生物樣品中左氧氟沙星濃度的檢測方法，獲得了左氧氟沙星胃漂浮微丸在大鼠體內的相關藥動學參數，并比較了其與普通片劑的藥動學差異，可為該劑型的深入研發奠定基礎。但由于體內藥動學的復雜性與樣本量有限等問題，仍需對其藥動學參數與藥效學的相關性作進一步探討。