阿那其根醇提取物對咳嗽變異性哮喘模型大鼠的改善作用研究Δ

娜迪熱·伊卜拉伊木，劉長江，金小越#

（1.新疆醫科大學研究生學院，烏魯木齊830054；2.新疆醫科大學第六附屬醫院藥學部，烏魯木齊 830002）

阿那其根為菊科植物羅馬除蟲菊[Anacyclus pyrethrum（L）.DC］的干燥根，主要含有墻草堿、菊糖以及黃酮、揮發油、鞣質、氨基酸類成分[1］。本課題組前期測得阿那其根醇提取物（EEAP）主要含有綠原酸、菊糖、果糖、葡萄糖以及黃酮、生物堿類成分。有研究指出，EEAP具有抗炎、鎮痛作用，綠原酸和黃酮類可能是其主要的效應成分[2］。同時本課題組前期研究還發現，阿那其根原粉膠囊可緩解變異性咳嗽（CVA）患者的臨床癥狀[3］，但其抗炎、平喘作用的具體機制尚不清楚。為此，本研究以CVA模型大鼠為對象，初步探討EEAP對其的改善作用，旨在為阿那其根的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

TY0608型全波長酶標儀[伯樂生命醫學產品（上海）有限公司］；DMI4000B型熒光倒置顯微鏡[徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司］；402A1型超聲霧化器（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）；R-2003型旋轉蒸發儀、R-2003型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；DZF-6090型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；透明霧化盒（40 cm×20 cm×30 cm，實驗室自制）。

1.2 藥材、藥品與試劑

阿那其根藥材（批號:704025）購自新疆本草堂有限公司，經新疆維吾爾自治區食品藥品檢驗所主任藥師沙拉麥提·麥提鑒定為菊科植物羅馬除蟲菊[A.pyrethrum（L）.DC］的根。

醋酸潑尼松片（陽性對照，天津天藥藥業股份有限公司，批號:CP170620a2，規格:5 mg）；10%費氏完全佐劑、卵清蛋白（OVA）（美國Sigma公司，批號分別為1002551507、100263827）；超氧化物歧化酶（SOD）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為2018012025、2018012029）；水合氯醛（成都市科隆化學品有限公司，批號:2018041601）；10%中性多聚甲醛（南昌雨露實驗器材有限公司，批號:170913-2）；辣椒素（大連美侖生物科技有限公司，批號:TM1149；臨用前稱取30.5 mg，加聚山梨酯80和無水乙醇各l mL溶解，加至生理鹽水中，得10－2mol/L的辣椒素貯備液；經生理鹽水稀釋后，得10－4mol/L的辣椒素溶液）；蘇木精、伊紅、瑞氏染色劑（北京索萊寶科技有限公司）；其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

清潔級SD大鼠60只，雄性，2月齡，體質量180～220 g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供[動物使用許可證號:SYXK（新）2018-0003］。

2 方法

2.1 EEAP的制備

稱取阿那其根藥材適量，粉碎，用6倍量（g/mL）65%乙醇于50℃回流提取2 h，提取液濾過、濃縮，并冷凍干燥，即得EEAP。將其置于4℃冰箱中保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

所有大鼠均適應性飼養7 d后，按隨機數字表法分為6組，即對照組、模型組、醋酸潑尼松組（250 mg/kg，以水為溶劑；按成人臨床日劑量的7.5倍換算而得）和EEAP低、中、高劑量組[160、320、640 mg/kg，按EEAP質量計，以水為溶劑；參考預實驗結果按成人（60 kg）體表面積換算而得］，每組10只。除對照組外，其余各組大鼠均皮下注射新鮮配制的1 mg/mL OVA-費氏完全佐劑溶液（OVA以生理鹽水稀釋后，與10%費氏完全佐劑混合而得）致敏[4］:在大鼠后足跖、腹股溝、腰、背、頸部共取10點，每點注射0.05 mL，同時腹腔注射0.5 mL，共計l mL；1周后重復1次，增強致敏作用。造模后（即第1次注射后，下同）第15天，將大鼠置于透明霧化盒內，以400 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）恒壓噴入1%OVA-生理鹽水溶液（OVA以生理鹽水稀釋而得）每日1次、每次20 min、持續15 d以激發哮喘（大鼠腹肌明顯收縮，且出現呼吸加深、加快等呼吸道痙攣癥狀，即表明造模成功）。末次霧化后，對照組和模型組大鼠均灌胃等體積水，給藥組大鼠均灌胃相應藥物；每日1次，連續30 d。

2.3 一般體征觀察

分別于造模前后及給藥前后觀察各組大鼠的飲食、活動、毛發、大小便、體質量等一般體征的變化情況。

2.4 咳嗽情況觀察

采用辣椒素咳嗽激發實驗考察各組大鼠的氣道敏感性。末次給藥后，將各組大鼠放入透明霧化盒內，用10－4mol/L辣椒素溶液霧化60 s后，停止刺激，并在盒內停留60 s，記錄隨后2 min內各組大鼠的咳嗽次數。

2.5 氧化應激指標及炎癥因子含量檢測

進行辣椒素咳嗽激發實驗后，所有大鼠均禁食、不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）進行麻醉，將其用夾板固定，打開腹腔，于腹主動脈采血約5 mL，以3 500 r/min離心10 min，取上清液置于1.5 mL EP管中，置于－20℃冰箱中保存，備用。取上述血清樣品適量，采用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠血清SOD、TNF-α含量，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.6 肺組織形態學觀察

取血后，快速結扎各組大鼠右側肺門，取其右側肺下葉組織適量，用生理鹽水沖洗后，置于10%中性多聚甲醛中固定72 h，石蠟包埋、切片（厚度約4 μm），經蘇木精-伊紅（HE）染色后，置于顯微鏡下觀察其肺組織形態學特征。

2.7 肺泡灌洗液炎癥細胞計數

切開各組大鼠頸部皮膚，分離氣管并切開一小口，用灌洗針注入生理鹽水2 mL，灌洗3次，回收、合并灌洗液，以1 500 r/min離心10 min，沉淀用等量（g/mL）磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）涂片，經瑞氏染色劑染色后，置于顯微鏡下進行嗜酸性粒細胞及白細胞計數。染色結果判斷:正常細胞核呈紫紅色；嗜酸性粒細胞呈偏紅；白細胞核呈淺蘭色或不著色[5］。

2.8 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 EEAP對CVA模型大鼠一般體征的影響

對照組大鼠呼吸平穩，行動靈活，反應敏捷，毛色光澤，體質量增長穩定。在霧化吸入OVA前，其余各組大鼠呼吸平穩，但毛色失去光澤，個別大鼠體質量增長緩慢；在霧化吸入OVA后，上述大鼠均出現躁動不安、撓鼻、咳嗽、打噴嚏、呼吸急促、飲水量和口鼻分泌物增多等癥狀。經藥物處理后，各給藥組大鼠呼吸逐漸平穩，咳嗽次數相對減少，毛色逐漸恢復光澤，口鼻分泌物減少，反應變得靈敏。

3.2 EEAP對CVA模型大鼠咳嗽次數的影響

與對照組比較，模型組大鼠咳嗽次數顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠咳嗽次數均顯著減少，但EEAP各劑量組顯著多于醋酸潑尼松組，差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 各組大鼠咳嗽次數以及血清SOD、TNF-α含量比較（x±s，n＝10）Tab 1 Comparison of cough times and serum contents of SOD and TNF-α of rats in each group（x±s，n＝10）

3.3 EEAP對CVA模型大鼠血清SOD、TNF-α含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清SOD含量顯著降低，TNF-α含量顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清SOD含量均顯著升高，TNF-α含量均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而各給藥組上述指標組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

3.4 EEAP對CVA模型大鼠肺組織形態學特征的影響

對照組大鼠肺內各級支氣管結構正常，肺泡壁毛細血管無充血、缺血，肺泡腔內清潔無滲出，未見炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肺內各級支氣管壁黏膜上皮細胞損傷，黏液分泌增多，支氣管壁充血、水腫，可見大量炎癥細胞浸潤；各給藥組大鼠肺內各級支氣管壁黏膜上皮細胞損傷以及支氣管壁充血、水腫，炎癥細胞浸潤程度均較模型組明顯減輕，詳見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態學觀察（HE染色，×200）Fig 1 Pathological observation of lung tissue of rats in each group（HE staining，×200）

3.5 EEAP對CVA模型大鼠肺泡灌洗液炎癥細胞計數的影響

與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞、白細胞計數均顯著升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠嗜酸性粒細胞、白細胞計數均顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而各給藥組上述指標組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

4 討論

CVA是以頑固性咳嗽為主要臨床表現的一種特定類型的哮喘，無明顯喘息和氣促等特征，其病理生理變化與哮喘相同，即持續性慢性氣道炎癥反應，且具高反應性[6］。CVA發病率較高，且可發生于任何年齡段，具有病程長、并發癥多、咳嗽明顯、發作反復等特點[7］。目前，CVA被認為是慢性咳嗽最常見的病因之一，其特點是夜間或清晨的刺激性咳嗽，嚴重影響患者的生活質量，并可能導致部分患者發展為典型哮喘[6］。近年來，CVA患病人數不斷增多，誤診率升高，故臨床應予以重視，督促患者及時治療，以防止其發展成為咳嗽性哮喘[8-9］。CVA的治療方法較多，西醫以腎上腺皮質激素、白三烯受體拮抗藥和β受體激動藥為主，但長期應用具有副作用大且停藥后易復發等缺點[10］。中醫藥在治療慢性疾病領域具有多靶點、多途徑的優勢，故受到越來越多臨床學者的關注[11］。本課題組前期研究發現，阿那其根原粉膠囊可改善CVA患者的臨床癥狀[3］。故本研究在成分分析的基礎上，參照文獻的方法[4］復制了大鼠CVA模型，并以醋酸潑尼松（該藥主要用于過敏性與自身免疫性炎癥性疾病，是臨床治療CVA等疾病的常用藥物）為陽性對照，初步探討了EEAP對模型大鼠的改善作用。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液炎癥細胞計數比較（x±s，n＝10，×109L－1）Tab 2 Comparison of inflammatory cell count in alveolar lavage fluid of rats in each group（x±s，n＝10，×109L－1）

有研究表明，CVA的發生除與氣道高反應及神經調節有關外，還與免疫學、遺傳學、感染、環境等多種因素有關，且氧化應激和炎癥反應是其主要病理機制之一[12］。SOD是機體內重要的抗氧化劑，其活性的強弱反映了體內抗氧化能力的高低；TNF-α具有參與炎癥反應、參與免疫應答等多種生物學活性，與CVA的發生、發展密切相關[13］。CVA作為一種變態反應性疾病，其發展的主要特征為機體內白細胞數量的顯著上升；同時，以嗜酸性粒細胞介導的炎癥反應在疾病發生、發展過程中起著重要作用[14］。本研究結果顯示，在接受抗原激發后，除對照組外其余各組大鼠均出現躁動不安、撓鼻、咳嗽、打噴嚏、呼吸急促、飲水量及口鼻分泌物增多等癥狀；與對照組比較，模型組大鼠咳嗽次數顯著增加，血清TNF-α含量顯著上升，血清SOD含量顯著降低，氣道管壁充血、水腫且炎癥細胞浸潤明顯，嗜酸性粒細胞及白細胞計數均顯著升高，提示模型復制成功。經藥物干預后，各給藥組大鼠呼吸逐漸平穩，咳嗽次數相對減少，毛色逐漸恢復光澤，口鼻分泌物減少，反應變得靈敏；與模型組比較，各給藥組大鼠咳嗽次數顯著減少（但EEAP各劑量組高于醋酸潑尼松組），血清TNF-α含量顯著降低，血清SOD含量顯著升高，氣道管壁充血、水腫及炎癥細胞浸潤等癥狀明顯改善，且嗜酸性粒細胞及白細胞計數均顯著降低。這提示EEAP可明顯減少大鼠咳嗽次數，緩解氣道炎癥反應，減少炎癥細胞浸潤，并增強機體抗氧化能力；此外，除減少大鼠咳嗽次數外，其余作用與陽性對照藥物相當，但仍待后續研究進一步確認。

綜上所述，EEAP可能是通過抑制TNF-α分泌、提高SOD含量、抑制炎癥細胞浸潤等途徑來發揮對CVA模型大鼠的平喘、抗炎作用。但本研究尚不深入，CVA相關指標（如其他炎癥因子、氧化應激指標以及免疫指標等）及具體作用機制仍有待進一步探討。