一測多評法同時測定薏苡仁油中4種甘油三酯類抗腫瘤成分的含量Δ

吳人杰，許平翠，壽旦，李功華，蘭青山，王娜妮#

（1.浙江省中醫藥研究院中藥研究中心，杭州310007；2.浙江中醫藥大學藥學院，杭州 310053；3.北京華邈藥業有限公司，北京 102600）

薏苡仁收載于2015年版《中國藥典》（一部），為禾本科植物薏苡[Coix lacryma-jobiL.var.mayuen.（Roman.）Stapf］的干燥成熟種仁，具有健脾利濕、除痹止瀉、清熱排膿等功效，用于治療水腫、腳氣、小便不利、濕痹拘攣、脾虛泄瀉、肺癰、腸癰、扁平疣等疾病[1］。薏苡仁的主要活性成分包括酯類、不飽和脂肪酸類、糖類及內酰胺類等[2］。有研究表明，薏苡仁及其活性成分具有抗腫瘤、抗炎、提高免疫力、降糖等藥理作用[3］。其中，研究者對薏苡仁油的關注頗多。薏苡仁油是從薏苡仁的種核中提取的，有研究證實薏苡仁油具有抑制腫瘤細胞增殖和提高免疫力的作用，可用于肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤的治療[4-5］。薏苡仁油中主要抗腫瘤成分是甘油三酯類成分[6］，包括甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-油酸甘油酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1，2-油酸-3-亞油酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯、1，2-油酸-3-棕櫚酸甘油酯等，但上述成分的對照品來源有限且價格昂貴，增加了檢測成本。目前，薏苡仁抗腫瘤成分的含量測定方法主要采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法（HPLC-ELSD）[7］，研究的主要成分是甘油三油酸酯，而針對其他甘油酸酯類成分的研究較少，故難以全面有效地評價薏苡仁的質量。鑒于此，筆者采用一測多評法，以常見易得、檢測技術成熟的甘油三油酸酯為內標，分別計算其與甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯的相對校正因子（RCF），利用RCF測定上述成分的含量，并將結果與外標法測得數據進行比較，旨在實現薏苡仁中4種甘油三酯類抗腫瘤成分的同時測定及檢驗成本的降低。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括Alltech 2000型ELSD（日本Shimadzu公司）；U3000型HPLC儀，包括Alltech 3300型ELSD（美國Thermo公司）；KQ-400DE型數控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；AE 50型電子天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司］；800A型多功能粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甘油三油酸酯對照品（批號:111692-201605，純度:＞99%）購自中國食品藥品檢定研究院；甘油三亞油酸酯對照品（批號:B26382，純度:＞95%）、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯對照品（批號:D460615，純度:＞98%）、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯對照品（批號:CFADP8577，純度:＞98%）均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈、異丙醇為色譜純，石油醚（60～90℃）為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

10批薏苡仁飲片樣品經浙江省中醫藥研究院藥用資源研究中心浦錦寶研究員鑒定為薏苡[Coix lacrymajobiL.var.mayuen.（Roman.）Stapf］的干燥成熟種仁，其來源見表1。采用多功能粉碎機將10批薏苡仁打粉過3號篩，備用。

表1 薏苡仁樣品來源Tab 1 Source of C.lacryma samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈-異丙醇（57∶43，V/V）；流速:1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。ELSD漂移管溫度：70℃；氣體流速:2 L/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯對照品適量，精密稱定，置于量瓶中，加流動相制成質量濃度均為1.0 mg/mL的對照品貯備液。分別取上述對照品貯備液適量，加流動相配制質量濃度分別為0.15、0.15、0.35、0.35 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取薏苡仁粉末3.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入石油醚30 mL，稱定質量，超聲（功率:300 W，頻率:28 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質量，用石油醚補足減失的質量，搖勻，濾過，減壓濃縮脫去石油醚，獲得薏苡仁油。取薏苡仁油30 mg，加流動相溶解，并定容至10 mL，經0.22 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 空白溶液 取流動相作為空白溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別精密量取“2.2”項下甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯質量濃度分別為0.15、0.15、0.35、0.35 mg/mL的混合對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，在該色譜條件下，各被測成分之間、被測成分與雜質峰均達到基線分離，4種成分的分離度均大于1.5，理論板數按甘油三油酸酯峰計應不低于5 000，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、5、10、20、30 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以進樣量的對數值（x）為橫坐標、峰面積的對數值（y）為縱坐標進行線性回歸，線性關系考察結果見表2。

調查問卷中態度部分共8個題項。受訪者對抗生素用藥的總體態度得分為31.71±3.93，得分范圍是8～40，表明醫生對抗生素的態度正確率處于中等水平。仍有25.2%的醫生非常同意或同意抗生素的靜脈注射比口服用藥效果更好；有31.7%的醫生非常同意或同意抗生素可預防急性上呼吸道感染的并發癥，受訪者對各題項的回答情況見表3。

表2 線性關系考察結果Tab 2 Results of linear relationship investigation

2.5 定量限與檢測限考察

分別取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，用流動相倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。當信噪比為10∶1時，得定量限；當信噪比為3∶1時，得檢測限。結果，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯的定量限分別為 0.13、0.06、0.07、0.12 μg，檢測限分別為 0.04、0.02、0.02、0.03 μg。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，每次10 μL，記錄峰面積。結果，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯峰面積的RSD分別為0.89%、0.69%、0.55%、0.60%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號:YYR09），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯峰面積的RSD分別為1.88%、1.13%、1.24%、1.01%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品粉末（批號:YYR09）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算樣品含量。結果，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯、甘油三油酸酯的平均含量分別為 0.70、0.49、0.75、0.91 μg/g，RSD 分別為 1.08%、1.04%、1.06%、1.16%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品粉末（批號:YYR09）適量，共6份，每份約3.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

2.10 一測多評法測定含量

2.10.1 RCF的計算 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液 1、5、10、20、30 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以甘油三油酸酯為內標，按公式fs/k＝fs/fk＝ck×As/cs×Ak（式中，cs為內標濃度，ck為待測物濃度，As為內標峰面積，Ak為待測物峰面積）[8］，分別計算甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯的RCF，結果見表4。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

表4 3種成分的RCF考察結果Tab 4 Results of RCF of 3 components

表5 不同色譜儀和不同色譜柱條件下測得的RCF Tab 5 RCF determined by different instruments andcolumns

2.10.3 待測組分色譜峰的定位 在無對照品的條件下，準確定位每個色譜峰是一測多評法成功應用的關鍵，可采用相對保留時間（rk/s）進行峰定位[9］。其中，rk/s=tR（k）/tR（s）[式中，tR（k）為待測物保留時間，tR（s）為內標保留時間］。本研究利用甘油三油酸酯對甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯的rk/s進行定性，測得各成分rk/s的RSD均小于5%，表明利用rk/s進行色譜峰的定位可行，結果詳見表6。

表6 不同色譜儀和不同色譜柱條件下測得的rk/sTab 6 Relative retention time determined by differentinstruments and columns

2.11 一測多評法和外標法測定結果比較

取10批薏苡仁樣品粉末，平行3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別采用一測多評法和外標法測定薏苡仁中4種甘油三酯類成分的含量，結果見表7。采用SPSS 19.0軟件對兩種方法所測結果進行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。結果，各待測成分含量檢測結果組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表7 樣品含量測定結果（n＝3，μg/g）Tab 7 Results of contents determination of samples（n＝3，μg/g）

3 討論

3.1 測定成分的選擇

甘油三酯類成分是薏苡仁中含有的主要活性成分之一，藥理活性顯著，且與薏苡仁的功效具有相關性[10］，是評價薏苡仁質量的適宜指標。另外，目前的研究很少涉及甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯的含量，但是以上化合物都具有顯著的抗腫瘤活性[11］，其作用強度不亞于甘油三油酸酯。因此，筆者選擇同時測定4種甘油三酯類成分的含量。

3.2 檢測方法的選擇

一測多評法是利用廉價易得的典型化學成分為對照，實現多個成分同時測定，能從整體上對中藥、飲片及制劑的質量進行控制[12-13］，此方法已在黃連[9］、川芎[14］、知母[15］、山茱萸[16］、黃芩[17］等藥材及中藥制劑中得以驗證。本試驗選擇可靠、成熟的外標法[18］測得數據結果與一測多評法測得數據結果進行對比來驗證一測多評法的準確性。本研究結果證明，一測多評法適合評價薏苡仁多種甘油三酯類成分的含量，有助于全面反映該類中藥飲片的質量水平。

3.3 內標的選擇

薏苡仁中甘油三酯類成分復雜且易分解和聚合，成本較高，甘油三油酸酯作為薏苡仁的指標性化合物，相較于其他甘油三酯類成分穩定、易得，含量適中，且國內外研究者對其均有相關研究報道[19］。同時，2015年版《中國藥典》（一部）也將其作為薏苡仁含量控制指標成分，因此筆者選擇薏苡仁作為一測多評法的內標。本文研究結果表明，甘油三油酸酯作為內標，能夠反映其他3種甘油三酯類成分的含量，具有較好的代表性。

3.4 色譜條件的選擇

在2015年版《中國藥典》（一部）中薏苡仁含量測定所用流動相為乙腈-二氯甲烷[1］。但經前期試驗發現，二氯甲烷對HPLC系統管路有腐蝕性，造成管路易堵，樣品含量測定不準確[20］，故本試驗選擇乙腈-異丙醇為流動相。

3.5 含量測定結果分析

由表7可知，來自8個不同產地薏苡仁飲片中甘油三酯類成分含量在0.33～2.76 μg/g范圍內。其中，1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯和甘油三油酸酯的含量相對較高，甘油三亞油酸酯和1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯的含量相對較低；此外結果還顯示，不同產地薏苡仁中甘油三酯類成分含量差異較明顯，貴州產薏苡仁中4種化學成分相較于其他產地均偏高，而浙江、重慶、廣西產地薏苡仁中4種化學成分相較于其他產地均偏低。這可能是因為貴州是薏苡仁的主產區，而甘油三酯類成分含量與其種植環境和種植技術密切相關[21］。

4 結語

文獻報道甘油三油酸酯是薏苡仁的主要活性成分[22］，甘油三亞油酸酯、1，2-亞油酸-3-棕櫚酸甘油酯、1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸甘油酯也具有抗腫瘤活性[23］，甘油三酯類成分的含量對薏苡仁藥效的發揮具有重要意義[24］。本研究通過建立薏苡仁一測多評法計算出薏苡仁中甘油三酯類成分的RCF，并考察了不同HPLC儀、不同色譜柱對其的影響，實測結果顯示其與外標法相比無明顯差異。由此可見，在僅有甘油三油酸酯對照品的情況下，可利用一測多評法對薏苡仁其他甘油三酯類成分含量進行估算。此法對薏苡仁的質量控制具有重要意義，也可為其藥效物質基礎研究提供依據。