GKT137831降低活性氧自由基水平來緩解阿托伐他汀所致的骨骼肌糖攝取下降

張 榮, 楊鑫泉, 熊 婷, 唐 姍, 艾可青,鐘紅艷, 毛永清, 王大新

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225001; 2. 中南大學湘雅醫學院, 湖南 長沙, 410000;3. 大連醫科大學, 遼寧 大連, 116000)

目前，他汀類藥物已改變心血管疾病(CVD)的一級和二級預防，循證數據[1]證實了他汀類藥物治療的療效和安全性，有助于指導臨床醫生管理 CVD 高危人群。隨著對他汀類藥物的深入研究，大量臨床試驗、薈萃分析和觀察性研究[2-4]發現，接受他汀類藥物治療的患者新發糖尿病(NODM)的風險增高，而對于經過強化他汀治療的患者和有NODM危險因素的患者，這種風險會進一步增高。阿托伐他汀作為高效能的他汀類藥物，與低效能他汀類藥物相比，其可中等程度地增加NODM風險[5]。目前，臨床上尚無有效的治療手段可以完全阻斷高效能他汀類藥物導致的NODM。目前關于他汀類藥物致NODM的研究主要集中在他汀類藥物增加胰島素抵抗和損傷胰島B細胞功能方面，其中骨骼肌是人體中糖代謝最大的靶器官，參與了機體85%的糖代謝。因此，在他汀類藥物導致NODM的過程中，骨骼肌可能是此類藥物發生糖代謝紊亂的主要靶點。活性氧自由基(ROS)不僅參與了生理信號轉導，在一些疾病中也參與病理生理信號轉導，如糖尿病及代謝性疾病。

在小鼠源性的骨骼肌細胞中, NADPH氧化酶4(Nox4)呈現高表達，該酶是骨骼肌中ROS的重要來源之一[6-7]。研究[8]證實，減少Nox4源性的ROS可有效改善2型糖尿病大鼠內皮細胞的胰島素抵抗。GKT137831作為Nox4的抑制劑，具有良好的抗氧化功能，已用于臨床二期實驗。本研究嘗試論證阿托伐他汀致骨骼肌糖攝取下降可能與ROS水平增加有關，而GKT137831可能具有通過減少ROS的產生而緩解他汀類藥物致NODM的作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞培養

小鼠C2C12骨骼肌細胞購自中國科學院細胞庫(蘇州)，GKT137831購自MCE公司，阿托伐他汀、兔β-actin抗體購自美國Sigma公司, CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所，H2DCFDA、2-NBDG購自美國Invitrogen公司，兔Nox4抗體購自美國Abcam公司。ECL化學發光試劑購自美國Thermo公司; 高糖DMEM培養基購自美國HyClone公司; 胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)購自美國GIBCO公司; 青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司。骨骼肌C2C12培養條件均為: DMEM培養基(高糖，含10%FBS、1%雙抗)，37 ℃、5% CO2培養24 h，待細胞長至70%～80%匯合度，更換為含2%馬血清的完全培養基，每隔24 h換液，養至第5天，形成成熟的肌管細胞，向培養基中加入1 μmol/L和10 μmol/L的阿托伐他汀，處理48 h。

1.2 CCK-8 法檢測細胞活性

C2C12細胞以2×104個/孔密度接種于96孔板中，分為3組，分別加入0、1、10 μmol/L阿托伐他汀處理。藥物處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養1 h后，于酶標儀450 nm波長讀數，檢測吸光度。細胞活力(%)=[(阿托伐他汀組-空白組)/(對照組-空白組)]×100%。

1.3 流式細胞儀檢測技術檢測骨骼肌細胞糖

攝取能力

C2C12細胞以6×105的密度接種在6孔板上。分化后的細胞給予阿托伐他汀(1、10 μmol/L)處理48 h。加入2-NBDG染料30 min室溫避光共培養，用冰冷的1×PBS終止反應后，用0.1%Triton-X100消化細胞。流式細胞儀檢測細胞糖攝取的變化(激發波長為485 nm, 發射波長為535 nm)。

1.4 流式細胞儀檢測技術檢測骨骼肌胞內ROS

水平

阿托伐他汀干預成熟的肌管細胞后加入10 μmol/L DCFH-DA室溫下避光孵育30 min。收集細胞，流式細胞儀檢測細胞內ROS水平(激發波為485 nm，發射波為525 nm)。

1.5 Western blot檢測阿托伐他汀干預后骨骼肌

細胞Nox4表達情況

收集細胞，用RIPA溶液(含蛋白酶抑制劑抑制劑)裂解提取蛋白，以Bradford法進行蛋白定量，按每孔40 μg蛋白上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠濃度為5%, 分離膠濃度為10%。采用濕轉方法將蛋白轉至0.2 μmol/L硝酸纖維膜，使用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉2 h, Nox4抗體中(稀釋濃度1∶4 000)4 ℃孵育過夜。二抗(1∶2 000稀釋)孵育時間為1 h, 使用伯樂XRS化學發光成像分析儀顯影成像。

1.6 統計學分析

采用SPSS 19.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 阿托伐他汀對骨骼肌C2C12細胞生長無影響

為驗證阿托伐他汀抑制骨骼肌C2C12細胞糖攝取并非是通過損傷細胞發生的，以CCK-8法檢測阿托伐他汀(1、10 μmol/L)處理48 h后骨骼肌細胞的活性。結果顯示，與對照組相比，阿托伐他汀處理后C2C12細胞生長活性不受影響，提示阿托伐他汀抑制骨骼肌細胞糖攝取并不是由于損傷細胞所致。見圖1。

圖1 阿托伐他汀(1、10 μmol/L)處理48 h后C2C12細胞活性

2.2 阿托伐他汀通過增加ROS水平致骨骼肌細胞糖攝取能力下降

為了驗證阿托伐他汀致NODM可能是由于其增加了ROS水平進而損傷骨骼肌細胞糖攝取，本研究采用流式細胞儀檢測阿托伐他汀(1、10 μmol/L)干預骨骼肌細胞48 h后糖攝取的情況。結果顯示，阿托伐他汀處理骨骼肌細胞后，與對照組相比, ROS水平明顯升高(圖2A), 同時糖攝取能力顯著下降(圖2B)，提示阿托伐他汀致NODM可能是通過增加ROS水平所致的。

2.3 阿托伐他汀增加骨骼肌細胞中Nox4的表達

研究已證實Nox4是骨骼肌中ROS的主要來源之一, Nox4的過表達參與了糖尿病的發生、發展。本研究采用Western blot法檢測阿托伐他汀干預骨骼肌細胞48 h后Nox4的表達情況，結果顯示，與對照組相比，Nox4蛋白的表達顯著增加。見圖3。

2.4 GKT137831通過降低ROS水平緩解阿托伐他汀所致的骨骼肌糖攝取下降

GKT137831作為Nox4的抑制劑，可以有效抑制Nox4的活性而不影響Nox4的表達，進而減少Nox4源性的ROS產生。為了驗證GKT137831對阿托伐他汀干預骨骼肌的保護作用，將GKT137831(10 nmol/L)和阿托伐他汀(1、10 μmol/L)共孵育48 h, 用流式細胞儀分別檢測糖攝取和ROS水平，結果顯示, GKT137831可以部分增強骨骼肌糖攝取能力，降低ROS水平，見圖4。

A: 阿托伐他汀干預骨骼肌細胞48 h, 流式細胞儀檢測提示ROS水平明顯增加;

B: 阿托伐他汀干預骨骼肌細胞可致細胞糖攝取能力顯著下降。

與對照組比較, **P<0.01, ***P<0.001。

圖2 阿托伐他汀通過增加ROS水平致骨骼肌細胞糖攝取能力下降

阿托伐他汀干預骨骼肌細胞48 h, Western blot法檢測提示Nox4蛋白表達顯著增加。與對照組比較, ***P<0.001。

A: GKT137831(10 nmol/L)可部分緩解阿托伐他汀(1、10 μmol/L)所致的糖攝取下降; B: GKT137831(10 nmol/L)

可降低阿托伐他汀(1、10 μmol/L)干預所致的ROS水平升高。與對照組比較, **P<0.01, ***P<0.001;

與阿托伐他汀組比較, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001。

圖4 GKT137831通過降低ROS水平緩解阿托伐他汀所致的骨骼肌糖攝取下降

2.5 阿托伐他汀對骨骼肌的影響

骨骼肌是人體中葡萄糖代謝重要的靶器官，約占機體葡萄糖處理量的75.0%[9]。他汀類藥物是最常用的處方藥，用于抑制膽固醇的合成，減少心血管不良事件的發生[10]。然而，他汀類藥物使用導致的相關肌肉疾病的不良反應是患者中斷治療最常見的原因[11]。此外，近年來發現他汀類藥物可致骨骼肌中相關糖代謝受損，主要表現在干擾葡萄糖轉運體4向細胞膜的轉位過程，進而影響骨骼肌對葡萄糖的攝取過程[12]。本模型中，阿托伐他汀通過增加Nox4的表達、提升ROS水平而降低骨骼肌細胞對糖攝取的能力，用Nox4活性抑制劑GKT137831可降低ROS水平，從而緩解阿托伐他汀對骨骼肌糖攝取的影響，提示GKT137831可能是緩解他汀類藥物不良反應潛在的有效策略。

3 討 論

他汀類藥物作為目前常用的降脂藥，自20世紀80年代用于臨床后，已顯著降低心血管不良事件的發生率[1, 13-14]。然而，最近的臨床試驗[15]表明，接受他汀類藥物(尤其是以阿托伐他汀為代表的高效能他汀藥)治療的患者，其新發糖尿病(NODM)的發病風險顯著增加。

目前，關于他汀類藥物致NODM的分子機制仍在探索中。已有文獻[16]報道，阿托伐他汀能降低胰島素介導的葡萄糖攝取，這是由于葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)向細胞膜轉位受損以及胰島素誘導的胰島素受體-1酪氨酸磷酸化和AKT絲蘇氨酸磷酸化程度下降所致。盡管本研究未涉及胰島素信號通路，但本研究結果顯示，在無胰島素刺激的情況下，阿托伐他汀同樣可以降低骨骼肌細胞對糖攝取的能力，提示在骨骼肌糖代謝過程中，阿托伐他汀不僅影響了胰島素介導的葡萄糖攝取過程，而且干預了無胰島素刺激狀態下骨骼肌的糖攝取，加重了胰島素抵抗的發生、發展。Mita等[17]研究比較了普伐他汀與阿托伐他汀治療對2型糖尿病患者β細胞功能的影響。與普伐他汀相比，阿托伐他汀對胰島β細胞未見保護作用，甚至可以降低胰島β細胞分泌胰島素的能力。

GKT137831作為Nox4的新型抑制劑，可有效減少肝炎模型中肝臟星狀細胞ROS的產生，緩解肝臟纖維化及肝臟細胞凋亡的發生、發展[18]。此外，該藥對腎臟的保護作用已在三種不同的糖尿病腎病動物模型中得到證實, GKT137831可顯著降低糖尿病腎病模型鼠中ROS水平，緩解糖尿病腎臟血管病變[19-21]。由于該藥具有良好的抗氧化功能，目前已進入臨床二期試驗，用于糖尿病并發癥的防治研究。然而, GKT137831是否可以在骨骼肌中發揮其抗氧化功能，進而降低骨骼肌中的ROS水平，保護骨骼肌的糖代謝，目前尚不清楚[22]。本研究結果顯示，在骨骼肌細胞中, GKT137831可部分緩解阿托伐他汀所致的葡萄糖攝取下降，同時觀察到該藥可緩解阿托伐他汀所致的ROS水平增加。提示GKT137831可在骨骼肌細胞中發揮其抗氧化的功能，緩解阿托伐他汀對骨骼肌糖攝取的影響。

綜上所述，他汀類藥物，尤其是以阿托伐他汀為代表的高效能他汀藥物，不僅可致胰島素抵抗的發生、發展，還可影響胰島β細胞分泌胰島素的能力。