GKT137831降低活性氧自由基水平來(lái)緩解阿托伐他汀所致的骨骼肌糖攝取下降

張 榮, 楊鑫泉, 熊 婷, 唐 姍, 艾可青,鐘紅艷, 毛永清, 王大新

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙, 410000;3. 大連醫(yī)科大學(xué), 遼寧 大連, 116000)

目前，他汀類(lèi)藥物已改變心血管疾病(CVD)的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防，循證數(shù)據(jù)[1]證實(shí)了他汀類(lèi)藥物治療的療效和安全性，有助于指導(dǎo)臨床醫(yī)生管理 CVD 高危人群。隨著對(duì)他汀類(lèi)藥物的深入研究，大量臨床試驗(yàn)、薈萃分析和觀察性研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，接受他汀類(lèi)藥物治療的患者新發(fā)糖尿病(NODM)的風(fēng)險(xiǎn)增高，而對(duì)于經(jīng)過(guò)強(qiáng)化他汀治療的患者和有NODM危險(xiǎn)因素的患者，這種風(fēng)險(xiǎn)會(huì)進(jìn)一步增高。阿托伐他汀作為高效能的他汀類(lèi)藥物，與低效能他汀類(lèi)藥物相比，其可中等程度地增加NODM風(fēng)險(xiǎn)[5]。目前，臨床上尚無(wú)有效的治療手段可以完全阻斷高效能他汀類(lèi)藥物導(dǎo)致的NODM。目前關(guān)于他汀類(lèi)藥物致NODM的研究主要集中在他汀類(lèi)藥物增加胰島素抵抗和損傷胰島B細(xì)胞功能方面，其中骨骼肌是人體中糖代謝最大的靶器官，參與了機(jī)體85%的糖代謝。因此，在他汀類(lèi)藥物導(dǎo)致NODM的過(guò)程中，骨骼肌可能是此類(lèi)藥物發(fā)生糖代謝紊亂的主要靶點(diǎn)。活性氧自由基(ROS)不僅參與了生理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在一些疾病中也參與病理生理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如糖尿病及代謝性疾病。

在小鼠源性的骨骼肌細(xì)胞中, NADPH氧化酶4(Nox4)呈現(xiàn)高表達(dá)，該酶是骨骼肌中ROS的重要來(lái)源之一[6-7]。研究[8]證實(shí)，減少Nox4源性的ROS可有效改善2型糖尿病大鼠內(nèi)皮細(xì)胞的胰島素抵抗。GKT137831作為Nox4的抑制劑，具有良好的抗氧化功能，已用于臨床二期實(shí)驗(yàn)。本研究嘗試論證阿托伐他汀致骨骼肌糖攝取下降可能與ROS水平增加有關(guān)，而GKT137831可能具有通過(guò)減少ROS的產(chǎn)生而緩解他汀類(lèi)藥物致NODM的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠C2C12骨骼肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(蘇州)，GKT137831購(gòu)自MCE公司，阿托伐他汀、兔β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司, CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，H2DCFDA、2-NBDG購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔Nox4抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司; 高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司; 胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司; 青鏈霉素混合液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。骨骼肌C2C12培養(yǎng)條件均為: DMEM培養(yǎng)基(高糖，含10%FBS、1%雙抗)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%匯合度，更換為含2%馬血清的完全培養(yǎng)基，每隔24 h換液，養(yǎng)至第5天，形成成熟的肌管細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入1 μmol/L和10 μmol/L的阿托伐他汀，處理48 h。

1.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性

C2C12細(xì)胞以2×104個(gè)/孔密度接種于96孔板中，分為3組，分別加入0、1、10 μmol/L阿托伐他汀處理。藥物處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)讀數(shù)，檢測(cè)吸光度。細(xì)胞活力(%)=[(阿托伐他汀組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)]×100%。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞糖

攝取能力

C2C12細(xì)胞以6×105的密度接種在6孔板上。分化后的細(xì)胞給予阿托伐他汀(1、10 μmol/L)處理48 h。加入2-NBDG染料30 min室溫避光共培養(yǎng)，用冰冷的1×PBS終止反應(yīng)后，用0.1%Triton-X100消化細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞糖攝取的變化(激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)骨骼肌胞內(nèi)ROS

水平

阿托伐他汀干預(yù)成熟的肌管細(xì)胞后加入10 μmol/L DCFH-DA室溫下避光孵育30 min。收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平(激發(fā)波為485 nm，發(fā)射波為525 nm)。

1.5 Western blot檢測(cè)阿托伐他汀干預(yù)后骨骼肌

細(xì)胞Nox4表達(dá)情況

收集細(xì)胞，用RIPA溶液(含蛋白酶抑制劑抑制劑)裂解提取蛋白，以Bradford法進(jìn)行蛋白定量，按每孔40 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠濃度為5%, 分離膠濃度為10%。采用濕轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)至0.2 μmol/L硝酸纖維膜，使用含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉2 h, Nox4抗體中(稀釋濃度1∶4 000)4 ℃孵育過(guò)夜。二抗(1∶2 000稀釋)孵育時(shí)間為1 h, 使用伯樂(lè)XRS化學(xué)發(fā)光成像分析儀顯影成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 阿托伐他汀對(duì)骨骼肌C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響

為驗(yàn)證阿托伐他汀抑制骨骼肌C2C12細(xì)胞糖攝取并非是通過(guò)損傷細(xì)胞發(fā)生的，以CCK-8法檢測(cè)阿托伐他汀(1、10 μmol/L)處理48 h后骨骼肌細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，阿托伐他汀處理后C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)活性不受影響，提示阿托伐他汀抑制骨骼肌細(xì)胞糖攝取并不是由于損傷細(xì)胞所致。見(jiàn)圖1。

圖1 阿托伐他汀(1、10 μmol/L)處理48 h后C2C12細(xì)胞活性

2.2 阿托伐他汀通過(guò)增加ROS水平致骨骼肌細(xì)胞糖攝取能力下降

為了驗(yàn)證阿托伐他汀致NODM可能是由于其增加了ROS水平進(jìn)而損傷骨骼肌細(xì)胞糖攝取，本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)阿托伐他汀(1、10 μmol/L)干預(yù)骨骼肌細(xì)胞48 h后糖攝取的情況。結(jié)果顯示，阿托伐他汀處理骨骼肌細(xì)胞后，與對(duì)照組相比, ROS水平明顯升高(圖2A), 同時(shí)糖攝取能力顯著下降(圖2B)，提示阿托伐他汀致NODM可能是通過(guò)增加ROS水平所致的。

2.3 阿托伐他汀增加骨骼肌細(xì)胞中Nox4的表達(dá)

研究已證實(shí)Nox4是骨骼肌中ROS的主要來(lái)源之一, Nox4的過(guò)表達(dá)參與了糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。本研究采用Western blot法檢測(cè)阿托伐他汀干預(yù)骨骼肌細(xì)胞48 h后Nox4的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Nox4蛋白的表達(dá)顯著增加。見(jiàn)圖3。

2.4 GKT137831通過(guò)降低ROS水平緩解阿托伐他汀所致的骨骼肌糖攝取下降

GKT137831作為Nox4的抑制劑，可以有效抑制Nox4的活性而不影響Nox4的表達(dá)，進(jìn)而減少Nox4源性的ROS產(chǎn)生。為了驗(yàn)證GKT137831對(duì)阿托伐他汀干預(yù)骨骼肌的保護(hù)作用，將GKT137831(10 nmol/L)和阿托伐他汀(1、10 μmol/L)共孵育48 h, 用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)糖攝取和ROS水平，結(jié)果顯示, GKT137831可以部分增強(qiáng)骨骼肌糖攝取能力，降低ROS水平，見(jiàn)圖4。

A: 阿托伐他汀干預(yù)骨骼肌細(xì)胞48 h, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示ROS水平明顯增加;

B: 阿托伐他汀干預(yù)骨骼肌細(xì)胞可致細(xì)胞糖攝取能力顯著下降。

與對(duì)照組比較, **P<0.01, ***P<0.001。

圖2 阿托伐他汀通過(guò)增加ROS水平致骨骼肌細(xì)胞糖攝取能力下降

阿托伐他汀干預(yù)骨骼肌細(xì)胞48 h, Western blot法檢測(cè)提示Nox4蛋白表達(dá)顯著增加。與對(duì)照組比較, ***P<0.001。

A: GKT137831(10 nmol/L)可部分緩解阿托伐他汀(1、10 μmol/L)所致的糖攝取下降; B: GKT137831(10 nmol/L)

可降低阿托伐他汀(1、10 μmol/L)干預(yù)所致的ROS水平升高。與對(duì)照組比較, **P<0.01, ***P<0.001;

與阿托伐他汀組比較, #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001。

圖4 GKT137831通過(guò)降低ROS水平緩解阿托伐他汀所致的骨骼肌糖攝取下降

2.5 阿托伐他汀對(duì)骨骼肌的影響

骨骼肌是人體中葡萄糖代謝重要的靶器官，約占機(jī)體葡萄糖處理量的75.0%[9]。他汀類(lèi)藥物是最常用的處方藥，用于抑制膽固醇的合成，減少心血管不良事件的發(fā)生[10]。然而，他汀類(lèi)藥物使用導(dǎo)致的相關(guān)肌肉疾病的不良反應(yīng)是患者中斷治療最常見(jiàn)的原因[11]。此外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物可致骨骼肌中相關(guān)糖代謝受損，主要表現(xiàn)在干擾葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位過(guò)程，進(jìn)而影響骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取過(guò)程[12]。本模型中，阿托伐他汀通過(guò)增加Nox4的表達(dá)、提升ROS水平而降低骨骼肌細(xì)胞對(duì)糖攝取的能力，用Nox4活性抑制劑GKT137831可降低ROS水平，從而緩解阿托伐他汀對(duì)骨骼肌糖攝取的影響，提示GKT137831可能是緩解他汀類(lèi)藥物不良反應(yīng)潛在的有效策略。

3 討 論

他汀類(lèi)藥物作為目前常用的降脂藥，自20世紀(jì)80年代用于臨床后，已顯著降低心血管不良事件的發(fā)生率[1, 13-14]。然而，最近的臨床試驗(yàn)[15]表明，接受他汀類(lèi)藥物(尤其是以阿托伐他汀為代表的高效能他汀藥)治療的患者，其新發(fā)糖尿病(NODM)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。

目前，關(guān)于他汀類(lèi)藥物致NODM的分子機(jī)制仍在探索中。已有文獻(xiàn)[16]報(bào)道，阿托伐他汀能降低胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取，這是由于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位受損以及胰島素誘導(dǎo)的胰島素受體-1酪氨酸磷酸化和AKT絲蘇氨酸磷酸化程度下降所致。盡管本研究未涉及胰島素信號(hào)通路，但本研究結(jié)果顯示，在無(wú)胰島素刺激的情況下，阿托伐他汀同樣可以降低骨骼肌細(xì)胞對(duì)糖攝取的能力，提示在骨骼肌糖代謝過(guò)程中，阿托伐他汀不僅影響了胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取過(guò)程，而且干預(yù)了無(wú)胰島素刺激狀態(tài)下骨骼肌的糖攝取，加重了胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展。Mita等[17]研究比較了普伐他汀與阿托伐他汀治療對(duì)2型糖尿病患者β細(xì)胞功能的影響。與普伐他汀相比，阿托伐他汀對(duì)胰島β細(xì)胞未見(jiàn)保護(hù)作用，甚至可以降低胰島β細(xì)胞分泌胰島素的能力。

GKT137831作為Nox4的新型抑制劑，可有效減少肝炎模型中肝臟星狀細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，緩解肝臟纖維化及肝臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展[18]。此外，該藥對(duì)腎臟的保護(hù)作用已在三種不同的糖尿病腎病動(dòng)物模型中得到證實(shí), GKT137831可顯著降低糖尿病腎病模型鼠中ROS水平，緩解糖尿病腎臟血管病變[19-21]。由于該藥具有良好的抗氧化功能，目前已進(jìn)入臨床二期試驗(yàn)，用于糖尿病并發(fā)癥的防治研究。然而, GKT137831是否可以在骨骼肌中發(fā)揮其抗氧化功能，進(jìn)而降低骨骼肌中的ROS水平，保護(hù)骨骼肌的糖代謝，目前尚不清楚[22]。本研究結(jié)果顯示，在骨骼肌細(xì)胞中, GKT137831可部分緩解阿托伐他汀所致的葡萄糖攝取下降，同時(shí)觀察到該藥可緩解阿托伐他汀所致的ROS水平增加。提示GKT137831可在骨骼肌細(xì)胞中發(fā)揮其抗氧化的功能，緩解阿托伐他汀對(duì)骨骼肌糖攝取的影響。

綜上所述，他汀類(lèi)藥物，尤其是以阿托伐他汀為代表的高效能他汀藥物，不僅可致胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展，還可影響胰島β細(xì)胞分泌胰島素的能力。