橙子果皮誘導抗病組分對意大利青霉的抑菌活性及作用機制

彭 洋，楊書珍，張美紅，程運江，彭麗桃,*

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學園藝林學學院，湖北 武漢 430070）

我國柑橘種植面積廣、品種多、資源豐富，其果實營養豐富，深受消費者歡迎[1]。但柑橘產地偏遠，同時果實成熟期集中，采后極易因感染病原菌腐爛變質而降低品質，造成較大的經濟損失和環境污染問題[2]，其中意大利青霉（Penicillium italicum）和指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的侵染性病害最為常見[3]。

目前，柑橘采后病害防治技術主要是通過如苯并咪唑、咪鮮胺、抑霉唑、丙環唑及鄰苯基苯酚鈉等化學殺菌劑處理果實[4]。但長期使用化學殺菌劑會帶來諸如病菌抗藥性、環境污染、食用安全風險等問題[5]。因此，各國都在積極探索效果良好且對人類無潛在危害的病害控制措施，包括如采用熱燙、覆膜和輻射處理等物理措施；利用通常被認為是安全的藥劑如碳酸鹽、殼聚糖等處理；采用微生物拮抗菌、生物活性物質和誘導自然抗性等生物防治措施，以及上述技術的綜合運用[6]。其中，植物誘導抗病性這種新興的生物防治方式已成為研究熱點，其主要是利用各類誘導因子使植物產生并積累植保素類的抗病物質，從而增強植物抗病性，抵抗病原菌的侵染[7]。

本課題組前期研究發現，接種毛霉（Actinomucor elegan）能刺激臍橙組織在接種部位局部產生紅色物質，在該位置再接種意大利青霉后果實不會腐爛，表明紅色物質與果實抗病性密切相關[8]。本實驗在制備出該物質的基礎上評價其對意大利青霉的體外抑菌活性，分析其對意大利青霉細胞壁、細胞膜通透性及細胞膜和細胞質組分的影響，探討其抑菌作用機制，以期為后續抑菌機理的深入研究及柑橘采后病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙產自贛南，從白沙洲水果批發市場采購后運送至實驗室進行相關處理。毛霉（Actinomucor elegan）由華中農業大學食品科技學院實驗中心保存，馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基4 ℃保存，備用。意大利青霉購自國家菌種保藏中心，PDA培養基4 ℃保存。

甲醇（色譜純）、二氯甲烷、石油醚、正庚烷、氯仿、濃硫酸、氫氧化鉀、次氯酸鈉溶液、無水乙醇國藥集團化學試劑有限公司；磷酸香草醛、D-硫酸鹽葡糖胺、熒光增白劑（calcofluor white，CFW） 上海甄準生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發儀 上海愛明儀器有限公司；光學顯微鏡、免疫熒光顯微鏡（immunof l urorescence microscopy，IFM） 美國INOVA Diagnostics公司；恒溫培養箱武漢德力祥儀器設備有限公司；高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 抗病性紅色物質的制備、分離及純化

臍橙用質量分數2%次氯酸鈉溶液清洗后再用清水清洗兩次，晾干。對每個果實進行造傷，傷口注射20～30 μL 1h107CFU/mL毛霉孢子懸浮液，置于26 ℃生化培養箱觀察培養4～5 d。將帶有紅色物質的果皮組織剝離，液氮研磨，冷凍保存備用。

取樣品粉末，加入甲醇，超聲浸提，4 ℃離心，收集上清液，重復提取兩次。提取液濃縮后用石油醚除去脂溶性成分，再用二氯甲烷萃取，萃取相過C18柱后冷凍干燥得到紅色物質，提取及分離純化過程中采用高效液相色譜檢測以確保所提物質為果皮紅色物質。

1.3.2 意大利青霉孢子萌發及芽管伸長的測定

參考柳麗梅等[9]的方法，取紅色物質溶液（體積分數20%甲醇溶液溶解）與培養基混勻，使培養基中紅色物質的最終質量濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg/mL，以無菌水作為空白對照（CK），將培養基涂于載玻片上，取20 μL意大利青霉孢子懸浮液，滴于凝固的含紅色物質的培養基上，放在26 ℃培養箱中培養，7～8 h后觀察孢子萌發情況，按式（1）、（2）計算孢子萌發率及抑制率。芽管伸長實驗操作步驟同上，在26 ℃培養11～12 h后測量芽管伸長長度。

1.3.3 意大利青霉絲生長量的測定

參考Yang Shuzhen等[10]的菌餅實驗方法。取適量紅色物質溶液與培養基混勻，使得培養基紅色物質的終質量濃度分別為25、50、100、200 μg/mL，將在PDA培養基上培養12 h的意大利青霉用打孔器打出直徑5 mm的菌餅，將菌餅反貼在含紅色物質的培養基上，每個培養皿貼3 塊，26 ℃培養，每24 h測量菌斑直徑。

菌絲生長量測定參考Dikbas等[11]的方法。將孢子懸浮液加入馬鈴薯-葡萄糖肉湯（potato-dextrose broth，PDB）培養基中，封口、搖勻，于恒溫振蕩培養箱中125 r/min、28 ℃培養24 h。將菌絲過濾，除去多余水分后用無菌水沖洗兩次，稱取3 g濕菌絲，分別加入紅色物質質量濃度為25、50、100、200 μg/mL的PDB培養基中，以無菌水作為空白對照（CK），繼續培養48 h。4 層紗布過濾菌絲，蒸餾水沖洗3 次，濾干表面水分后冷凍干燥，記錄菌絲干質量。

1.3.4 CFW染色觀察幾丁質轉移現象

參考Viragh等[12]的方法進行CFW染色，將意大利青霉孢子懸浮液分別涂布于紅色物質質量濃度為50、100 μg/mL的25 mL PDA平板上，以無菌水作為空白對照（CK），斜插無菌蓋玻片后封口，26 ℃倒置培養2 d，取出長有菌絲的蓋玻片，置于潔凈的載玻片上，滴加足量CFW染液和質量分數10% KOH溶液混合液（現配現用）充分浸潤菌絲，室溫染色1 min，蒸餾水洗去多余染液，IFM觀察，紫外光激發，菌絲細胞壁呈藍色熒光。實驗重復3 次。

1.3.5 幾丁質含量的測定

參考Viragh[12]和Stalhberger[13]等的方法。將意大利青霉孢子懸浮液接種于PDB培養基中，加入適量紅色物質溶液，控制最終質量濃度為50、100、200 μg/mL，以無菌水作空白對照（CK），26 ℃、125 r/min振蕩培養48 h，4 層紗布過濾菌絲，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗2 次，濾干水分。將菌絲除去蛋白質、脂質后冷凍干燥，取10 mg凍干粉末于10 mL離心管中，向各管中加0.5 mL 2 mol/L濃硫酸，沸水浴4 h充分裂解。收集裂解產物，12 000 r/min離心5 min，上清液用2 mol/L KOH調至pH 3，取100 μL加1 mL乙酰丙酮溶液，以蒸餾水為空白對照（CK），搖勻，沸水浴25 min，冷卻后加1.5 mL對二甲胺基苯甲醛溶液和3.0 mL無水乙醇，搖勻，60 ℃水浴1 h，測定各樣品在520 nm波長處的吸光度，用D-硫酸鹽葡糖胺做標準曲線，通過標準曲線計算幾丁質含量。

1.3.6 PI染色觀察菌絲體細胞膜的完整性

參考Ouyang Qiuli等[14]的方法，將意大利青霉孢子懸浮液分別涂布于紅色物質質量濃度為50、100 μg/mL的PDA培養基上，以無菌水作對照，斜插無菌蓋玻片后封口，26 ℃倒置培養2 d，取出蓋玻片，置于長有菌絲的潔凈載玻片上，滴幾滴50 μg/mL PI染色液（PBS配制），避光染色10 min，用蒸餾水洗去多余染色液，置于IFM下觀察。

1.3.7 菌絲膜外電導率的測定

參考Tao Nengguo等[15]的方法。菌絲培養方法同1.3.5節，稱取2.00 g濕菌絲于50 mL潔凈離心管中，用20 mL雙蒸水重懸，加入適量紅色物質溶液，控制最終質量濃度為50、100、200 μg/mL，以無菌水作空白對照（CK），用電導率儀測定加入紅色物質后0、30、60、90、120 min時溶液的電導率。

1.3.8 總脂質含量的測定

參考Ahmad等[16]的方法。菌絲培養方法同1.3.5節，將菌絲冷凍干燥，液氮研磨成干粉，4 ℃保存備用。精確稱取0.10 g菌絲干粉于10 mL離心管中，依次加入0.8 mL蒸餾水、1 mL甲醇、2 mL氯仿，漩渦振蕩，65 ℃水浴30 min，6 000hg離心，吸取全部氯仿相到另一離心管中，加入0.2 mL生理鹽水，漩渦振蕩后靜置分層，取氯仿相到玻璃試管中，加入500 μL濃硫酸，沸水浴10 min后加入3 mL磷酸香草醛，以無菌水作空白對照（CK）。測定520 nm波長處吸光度，用膽固醇做標準曲線。

1.3.9 麥角固醇含量的測定

參考Tian Jun等[17]的方法。菌絲培養方法同1.3.5節，稱取1.0 g濕菌絲于50 mL離心管中，加入4 mL質量分數25% KOH-乙醇溶液，劇烈振搖2 min后漩渦振蕩1 min，85 ℃水浴4 h，再加入2 mL蒸餾水和5 mL正庚烷，漩渦振蕩2 min，靜置1 h至完全分層，取上層正庚烷相，采用紫外-可見分光光度計掃描溶液在230～300 nm波長范圍內吸光度。

1.4 數據處理與分析

所有數據均為3 次平行實驗測定的平均值，用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 抗病性紅色物質對意大利青霉孢子萌發及芽管伸長的影響

表1 紅色物質對意大利青霉孢子萌發和芽管伸長的影響Table1 Effects of the red substances on spore germination and germ tube elongation of Penicillium italicum

由表1可看出，紅色物質能夠抑制意大利青霉孢子萌發和芽管伸長，且都呈現明顯的劑量-效應關系（P＜0.05）。紅色物質質量濃度為25、50、100 μg/mL時，孢子萌發率分別為（55.43f0.02）%、（33.61f0.03）%、（1.41f0.00）%，明顯低于空白對照組（91.42f0.01）%。同樣，各質量濃度處理組的芽管伸長長度也明顯低于空白對照組（（22.96f1.19）μm）；當紅色物質質量濃度達到200 μg/mL時孢子無法長出芽管。

2.2 抗病性紅色物質對意大利青霉菌絲生長的影響

圖1 紅色物質對意大利青霉菌絲生長的影響Fig.1 Effect of the red substances on mycelial growth of Penicillium italicum

意大利青霉的菌絲體生長受到紅色物質的劑量依賴性影響（圖1A），培養初期菌斑直徑增長顯著，但在培養48 h后處理組的菌斑直徑均明顯小于空白對照組；而質量濃度為200 μg/mL時，直到培養的第4天仍能完全抑制意大利青霉菌絲的生長。圖1B為液態培養后去除初始菌絲質量的菌絲干質量。經液態培養后，不同處理組的菌絲干質量都顯著低于空白對照組（（0.947f0.029）g），說明紅色物質對意大利青霉菌絲成熟期也表現出明顯抑制作用；紅色物質質量濃度達到200 μg/mL時，菌絲仍有生長（干質量為（0.270f0.009）g），說明菌絲成熟期的耐藥性較孢子萌發期強。

2.3 抗病性紅色物質對幾丁質分布的影響

圖2 CFW染色觀察紅色物質對菌絲幾丁質分布的影響Fig.2 Effect of the red substances on chitin distribution of mycelia observed by CFW staining

如圖2所示，明場下觀察，空白對照組菌絲粗壯、結構完整（圖2A1），而處理組菌絲多分枝（圖2B1），并生成分生孢子（圖2C1）；在暗場下觀察，對照組的少部分菌絲呈微弱的藍色熒光（圖2A2），處理組菌絲則呈現強烈藍色熒光（圖2B2、C2），質量濃度越高熒光越強，且菌絲末端熒光明顯弱于菌絲根部，細胞壁節間熒光強度更高，幾丁質轉移現象明顯。

2.4 紅色物質對意大利青霉菌絲細胞壁幾丁質含量的影響

圖3 紅色物質對意大利青霉菌絲細胞壁幾丁質含量的影響Fig.3 Effect of the red substances on chitin content of Penicillium italicum cell wall

總體來看，紅色物質處理會造成意大利青霉菌絲細胞壁的幾丁質含量下降（圖3）。相對于空白對照組（（71.017f1.928）μg/mg），紅色物質質量濃度分別為25、50、100 μg/mL時，幾丁質含量相應下降了22.52%、38.96%、65.26%，紅色物質質量濃度與幾丁質含量變化間呈現明顯的劑量-效應關系。

2.5 紅色物質對菌絲體細胞膜完整性的影響

圖4 意大利青霉菌絲PI染色觀察細胞膜完整性Fig.4 Cell membrane integrity of Penicilicum italicum observed with PI staining

明場下觀察，空白對照組菌絲長勢良好（圖4A1），而處理組的菌絲纖細，且在逆境生長條件下產生了分生孢子（圖4B1、C1）；暗場下觀察，對照組菌絲基本無紅色熒光（圖4A2），處理組菌絲則呈現較強的熒光，且熒光強度隨紅色物質質量濃度的增加而增強（圖4B2、C2）。

2.6 紅色物質對菌絲膜外電導率的影響

圖5 紅色物質對菌絲體膜外電導率的影響Fig.5 Effect of the red substances on extracellular conductivity of mycelia

如圖5所示，紅色物質對菌絲膜外電導率影響的劑量-效應關系顯著，各組的膜外電導率都隨時間變化而上升。紅色物質處理60 min時，質量濃度為50、100 μg/mL處理組的膜外電導率接近，且高于空白對照組；處理時間達到120 min時，50、100、200 μg/mL處理組的膜外電導率分別為（42.53f0.89）、（49.43f0.63）、（59.37f0.78）μS/cm，顯著高于空白對照組（（34.64f0.79）μS/cm）。

2.7 紅色物質對菌絲細胞膜總脂質含量和麥角固醇含量的影響

圖6 紅色物質對意大利青霉菌絲細胞膜總脂質含量（A）和麥角固醇含量（B）的影響Fig.6 Effect of the red substances on lipid (A) and ergosterol (B)contents in the cell membrane of mycelia of Penicillium italicus

如圖6所示，隨著紅色物質質量濃度的增加，菌絲體的細胞膜總脂質含量逐漸降低。相對于空白對照組（（149.519f4.121）mg/g），經過50、100、200 μg/mL紅色物質處理的菌絲細胞膜總脂質含量分別下降了38.880、64.659、94.030 mg/g。

隨著紅色物質質量濃度的增加，菌絲體的細胞膜麥角固醇含量顯著降低。經過100、200 μg/mL高質量濃度的紅色物質處理后，菌絲的細胞膜麥角固醇含量分別為（1.291f0.025）、（0.729f0.059）mg/g，顯著低于空白對照組（（2.038f0.104）mg/g），而50 μg/mL紅色物質處理的菌絲細胞膜麥角固醇含量下降幅度較小，為（1.845f0.056）mg/g。

3 討 論

毛霉誘導產生的紅色物質對意大利青霉的孢子萌發、芽管伸長、菌絲生長均有很強的抑制作用，且具有濃度效應，在質量濃度200 μg/mL時孢子萌發和菌絲生長幾乎被完全抑制。據報道，1.0 μL/mL檸檬醛能完全抑制意大利青霉的生長[16]；2.0 μL/mL松油醇對指狀青霉的孢子萌發有強烈的抑制作用[18]；對從Koelreuteria apiculata中分離出來的抗真菌物質2-苯乙醇進行活體實驗，發現其能夠抑制意大利青霉和指狀青霉生長的含量為1.5 μL/mL[19]。紅色物質的抗菌活性強于上述活性成分，表明其具有很強的抑菌活性，值得深入探討其可能的抑菌作用機制。

幾丁質作為絲狀真菌細胞壁的主要成分，構成了細胞壁的支架結構，也常被認為是抗菌劑作用于細胞壁的靶點[20]。通過CFW染色發現幾丁質轉移的現象，且紅色物質處理會降低菌絲的幾丁質含量，這說明其能夠造成細胞壁的主要成分幾丁質的缺失，使細胞支架結構遭到破壞。這與D-檸檬烯對酵母菌的抑菌研究中CFW染色觀察到幾丁質轉移現象[20]以及茴香精油的主要成分茴香腦能抑制毛霉幾丁質的合成[21]等研究的結果一致。

膜通透性是常見的抗真菌劑作用靶標。熒光染料PI是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，其不能通過活細胞膜，但能穿過破損的細胞膜，與細胞中的DNA結合產生紅色熒光[17]。IMF觀察表明紅色物質能夠破壞意大利青霉菌絲細胞膜的完整性，這與蒔蘿子精油對擴展青霉的細胞膜損傷[17]及過氧化氫對構巢曲霉細胞膜損傷[22]的結論一致。紅色物質對意大利青霉膜外電導率的測定結果表明，紅色物質能造成細胞膜跨膜電勢紊亂，導致離子外流，增加了膜通透性；這表明紅色物質可攻擊意大利青霉細胞膜，破壞膜通透性，造成細胞質流失，最終抑制菌絲生長。一些活性抗菌成分也有相似的抑菌作用機制，如檸檬醛精油對柑橘意大利青霉的抗菌機制[15]和蒔蘿子精油對黃曲霉的抗菌機制[17]可能是攻擊細胞膜和破壞菌絲結構；橙花醇能夠破壞葡萄黑曲霉細胞膜完整性和選擇透過性[23]；松油醇對指狀青霉也表現出了相似的抑菌機制[24]。

細胞膜脂質含量的降低會導致脂溶性物質運輸受阻和水溶性物質運輸加劇，破壞細胞膜的選擇透過性[25]。本研究結果表明，紅色物質降低了細胞膜總脂質含量，且存在劑量-效應關系。相似的結果在檸檬醛抑制柑橘意大利青霉的研究中[16]也得到驗證。作為真菌細胞膜的特有成分，麥角固醇在確保細胞膜結構的完整性與細胞膜結合酶的活性、細胞膜的流動性、細胞活力以及物質運輸方面起著重要作用，且是系列抑菌成分的重要作用靶點。紅色物質能夠顯著降低麥角固醇含量，說明其對意大利青霉細胞膜的作用靶點可能是細胞膜上的麥角固醇，能夠抑制麥角固醇的生物合成。其他相關研究也有類似結果：香芹酚能夠抑制白色念珠菌麥角固醇的合成[25]；丁香油酚降低了紅色毛蘚菌細胞膜麥角固醇含量[26]；紫蘇醛能夠抑制黑曲霉麥角固醇的合成[27]；香豆素能夠與曲霉細胞膜上的麥角固醇形成聚合物，導致細胞膜通透性增加，最終死亡[28]。這些結果表明，紅色物質通過抑制總脂質含量和麥角固醇含量抑制意大利青霉活性。

綜上所述，紅色物質對意大利青霉的生長有強烈的抑制作用，可造成菌絲細胞壁成分缺失和結構改變，破壞細胞膜完整性，增加其通透性，降低細胞膜脂質含量和麥角固醇含量，具有很高的應用開發價值。后續將進一步鑒定紅色物質的組成與結構，并探索其更高效的誘導機制和相應的生物學反應機制，為柑橘新型殺菌劑的研發、產業化及病害防治的實踐應用提供切實可行的途徑。