超高壓處理對養殖大黃魚肌原纖維蛋白結構的影響

張登科，張慧恩，朱艷杰，楊巨鵬，雷葉斯，楊 華,*，婁永江*

（1.寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315800；2.浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100）

大黃魚（Pseudosciaena crocea Richardson）屬于硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬，又名“黃花魚”、“長命魚”等[1]，是我國東海四大經濟魚類之一，其肉質細膩鮮美，富含蛋白質、維生素及二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等高不飽和脂肪酸，深受國內外消費者的喜愛[2]。上世紀80年代以來，由于過渡捕撈等原因，東海野生大黃魚已難以形成漁汛，隨著大黃魚人工育苗技術的突破，大黃魚現主要依靠人工養殖方式進行生產，我國是養殖大黃魚重要的出口國，養殖大黃魚具有較大的出口規模[3]。目前，我國養殖大黃魚以鮮活銷售為主，雖然其產量不斷增加，經濟效益卻未見大幅提升[4]。究其原因，主要是大黃魚不易保存[5]，現階段缺少良好的加工貯藏方式，大黃魚加工產品仍以初級加工的冷凍品、罐制品、腌制品等為主，精深加工及高附加值產品少[6]。因此，需要一種更好的加工保鮮處理方式來提高產品品質，提升養殖大黃魚產品附加值，這對全國養殖大黃魚產業發展及升級具有重大意義。

超高壓技術（high hydrostatic pressure，HHP）是一種新興食品加工技術，通過一定的液體介質（一般情況下為水），在一定的溫度下對樣品進行100～1 000 MPa處理[7]。HHP屬于純物理冷加工技術，利用高擠壓、高滲透及卸壓時的膨脹作用殺滅食品中的微生物，鈍化酶或使其部分失活，使蛋白質變性，從而避免熱加工的破壞作用，達到延長食品的貯藏期、保持食品原有的營養成分與風味[8-9]的效果，現階段HHP已在諸多食品領域有所運用[10]。HHP可以破壞維持蛋白空間結構的各種化學鍵，導致其空間結構改變，甚至使蛋白發生變性。而HHP對養殖大黃魚魚肉肌原纖維蛋白質結構的影響鮮有報道。

蛋白質構象復雜，檢測方法較多且各有側重：熒光分光光度法應用于分析其內源熒光性；傅里葉變換紅外光譜法應用于測定蛋白官能團結構；圓二色光譜（circular dichroism，CD）法應用于測定蛋白質二級結構；激光拉曼光譜法可快速、無損檢測蛋白質結構，定性、定量分析蛋白質功能基團的變化；掃描電子顯微鏡法用于觀察蛋白微觀結構。本研究以養殖大黃魚魚肉為原料，經過不同壓力和保壓時間下的HHP處理，通過熒光分光光度測定、傅里葉變換紅外光譜分析、CD分析、激光拉曼光譜分析、掃描電子顯微鏡觀察，研究HHP處理對養殖大黃魚肌原纖維蛋白結構及產品品質的影響，為HHP處理海水魚類生產加工提供理論支撐，進一步拓寬水產品及相關產品研發思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養殖大黃魚購于寧波路林市場，體質量為（0.5f0.1）kg，冰盒運回實驗室，清水沖洗，去頭、尾、皮、骨，取肉。魚肉置于絞肉機中絞碎至肉糜，分裝于10 cmh10 cm真空包裝袋中，每袋約22 g，真空包裝。Beyotime二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HPP.M1 HHP處理設備（0～600 MPa） 天津市華泰森淼生物工程技術有限公司；PL2002電子分析天平、FE20-pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZ-400雙室真空包裝機 寧波江東明興包裝設備物資有限公司；J-26XP高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；ALPHA2-4冷凍干燥儀 上海實維實驗儀器技術有限公司；FSH-2A可調高速勻漿機 上海維誠儀器有限公司；F4600熒光分光光度儀、E-1010鍍金儀、S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；inVia-reflex激光拉曼光譜儀 英國Renishaw公司；J-1500 CD儀 日本JASCO分光株式會社。

1.3 方法

1.3.1 HHP處理條件

將真空包裝的魚肉置于0 ℃冰溫環境下，分兩組進行HHP處理：第1組HHP條件為：壓力150、200、250、300、350、400、450、500 MPa，保壓時間10 min；第2組HHP條件為：壓力300 MPa，保壓時間5、10、15、20、25、30 min。水相保壓，升壓速率15 MPa/s，泄壓過程在3 s內完成，內腔溫度約4 ℃，以未處理組樣品為空白對照組，置于－40 ℃冰箱備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

參照Jiang Xinjing[11]和Chin[12]等的方法稍作修改。取適量魚肉，加4 倍體積4 ℃提取液（20 mmol/L pH 7.5磷酸鹽緩沖液），7 500 r/min勻漿60 s，4 ℃下7 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復勻漿、離心2 次。勻漿60 s，加4 倍體積冰洗液（0.1 mol/L NaCl溶液），7 000 r/min冷凍離心10 min，棄上清液，重復勻漿、離心1 次。勻漿60 s，加4 倍體積冰洗液，3 層紗布過濾，7 000 r/min 4 ℃冷凍離心10 min，肌原纖維蛋白沉淀稱質量后置于塑料培養皿中，包保鮮膜，－40 ℃冷凍48 h，于ALPHA2-4冷凍干燥儀中冷凍干燥24 h，將肌原纖維蛋白用液氮研磨成粉，真空包裝，干燥保存。

1.3.3 肌原纖維蛋白質量濃度的測定

稱取0.100 g肌原纖維蛋白樣品，溶于10 mL質量分數3.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，漩渦混勻5 s，37 ℃水浴30 min。采用Beyotime BCA蛋白濃度試劑盒測定濃度，稀釋液為質量分數3.5% SDS，將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96 孔板的標準品孔中，加稀釋液補足20 μL，即標準品終質量濃度分別為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL；加10 μL樣品到96 孔板的樣品孔中，加10 μL稀釋液補足20 μL并記錄樣品體積，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃恒溫搖床放置30 min，用酶標儀在593 nm波長處測定OD值，根據標準曲線和樣品體積計算出樣品蛋白的質量濃度。

1.3.4 肌原纖維蛋白熒光強度測定

參考Xu Yangshun等[13]的方法，精確稱取肌原纖維蛋白0.100 g，溶于5 mL質量分數3.5% SDS溶液中，37 ℃水浴2 h，濾紙過濾。設置激發波長為276 nm，發射波長范圍280～450 nm，掃描速率12 000 nm/min，以質量分數3.5% SDS作空白。

1.3.5 肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜測定

取適量樣品與100 mg KBr（質量比1∶100）混合，研磨、壓片。使用Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀于4 000～400 cm－1進行檢測，室溫25 ℃掃描并記錄光譜[14]。

1.3.6 肌原纖維蛋白CD測定

根據Masahiro等[15]的方法，配制0.02～0.20 mg/mL的樣品蛋白溶液，以蒸餾水為空白，于190～250 nm范圍內進行掃描，選用1 mm比色皿，室溫25 ℃，掃描速率為100 nm/min，0.25 s響應，消除本底，每組樣品重復掃描3 次。α-螺旋含量計算公式如下。

式中：θ208為樣品中殘基橢圓度/（deggcm2/dmol）。

1.3.7 肌原纖維蛋白激光拉曼光譜測定

取適量肌原纖維蛋白，采用inVia-reLex激光拉曼光譜儀測定，激發波長785 nm，掃描范圍400～3 200 cm－1，激發功率140 mW，曝光10 s/次，掃描3 次取平均值。

1.3.8 肌原纖維蛋白掃描電子顯微鏡觀察

將樣品制成2 mmh2 mmh1 mm的薄片，放入質量分數3%戊二酸溶液在4 ℃下固定24 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3 次，15 min/次；用質量分數1%鋨酸溶液固定樣品1 h，倒掉固定液，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗樣品3 次，15 min/次。依次用體積分數30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液對樣品進行脫水處理15 min[16]，再用無水乙醇處理2 次，每次10 min。依次用無水乙醇-叔丁醇混合液（體積比分別為3∶1、1∶1、1∶3）處理10 min，再用叔丁醇處理樣品10 min。加適量叔丁醇，放入－70 ℃冰箱2 h，然后放入冷凍干燥機干燥48 h，取適量樣品粘貼在樣品銅臺，采用E-1010鍍金儀鍍金，真空度1.32h10－5～1.32h10－6Pa，電壓1.1～1.2 kV，鍍膜2～3 min，掃描電子顯微鏡觀察。

1.4 數據處理

使用Off i ce Excel 2003軟件進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 HHP處理后肌原纖維蛋白內源熒光分析

圖1 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min內源熒光強度變化Fig.1 Endogenous fl uorescence spectra of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

圖2 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白內源熒光強度變化Fig.2 Endogenous fl uorescence spectra of myof i brillar proteins treated for different durations at 300 MPa

如圖1、2所示，肌原纖維蛋白的最大吸收波長（λmax）分布在320 nm左右，λmax在保壓時間10 min、壓力200 MPa時開始出現不同程度的紅移（λmax向長波長方向移動），隨著壓力的增大以及保壓時間的延長，紅移并沒有繼續，但熒光強度增強。λmax與色氨酸殘基所在的環境有很大的關系，當色氨酸殘基在蛋白質分子內部的非極性環境時，λmax小于330 nm；當色氨酸殘基在蛋白質分子外部的極性環境時，λmax大于330 nm。本研究中λmax在320 nm附近，表明色氨酸殘基大多在蛋白質內部的非極性環境中；λmax出現紅移說明經過HHP處理，養殖大黃魚肌原纖維蛋白色氨酸殘基移動到蛋白質的外部，使色氨酸殘基暴露在極性環境中，而熒光強度的改變則說明HHP處理使更多的色氨酸殘基暴露到蛋白質分子表面更強的極性環境中。HHP處理改變了肌原纖維蛋白中色氨酸殘基的微環境[17]。

2.2 HHP處理后肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min傅里葉變換紅外光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectra of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

圖4 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig.4 Fourier transform infrared spectra of myof i brillar proteins treated for different durations at 300 MPa

如圖3、4所示，樣品在紅外區出現若干個特征吸收峰，養殖大黃魚魚肉的肌原纖維蛋白在酰胺A帶（3 300 cm－1左右）、酰胺B帶（3 100 cm－1左右）、酰胺I帶（1 660 cm－1左右）、酰胺II帶（1 570、1 300 cm－1左右）都有吸收峰出現[18]。隨著壓力的增大，酰胺A帶峰值減弱，且隨著保壓時間的延長發生偏移，說明壓力的增大和保壓時間的延長使肌原纖維蛋白中的氫鍵發生變化。隨著壓力增加，1 742 cm－1處吸收峰消失，1 650 cm－1處吸收峰減弱，這都說明碳氧雙鍵（—C＝O）的結構或所處的化學環境發生了改變，可能是因為碳原子周圍電負性強的原子增加，使—C＝O上面的電子云密度減小，導致吸收峰減弱。在HHP處理過程中，可能是因為水分子在其作用下進入蛋白分子中，使大分子內部結構發生了一系列的變化，使肌原纖維蛋白二級結構改變。

2.3 HHP處理后肌原纖維蛋白CD分析

圖5 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min CD圖譜Fig.5 CD spectra of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

圖6 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白CD圖譜Fig.6 CD spectra of myof i brillar proteins treated for different durations at 300 MPa

蛋白質CD的190～240 nm為遠紫外區，是肽鍵的吸收范圍，同時也包含了主鏈構象信息。在222～208 nm波長范圍內會出現雙槽曲線（即負肩峰）是蛋白質結構中的α-螺旋結構的特征吸收峰[19]。由圖5、6可知，在208 nm和222 nm處出現兩個負凹槽，208 nm處為負肩峰，并且在210～220 nm波長之間存在一個很微弱的正峰。208 nm和222 nm負凹槽的負科頓效應是由于蛋白質α-螺旋結構引起的，220 nm波長處負肩峰的出現表示樣品存在β-折疊結構，210～220 nm波長處的微弱正峰表明該樣品無規卷曲結構的存在[20]。

150～500 MPa處理10 min時蛋白α-螺旋含量分別為14.66%、11.83%、10.39%、8.17%、5.40%、6.45%、4.61%、3.49%；隨著壓力的增大峰值逐漸變小，蛋白α-螺旋含量隨著壓力增加而減小。300 MPa處理5～30 min時蛋白α-螺旋含量分別為7.78%、8.17%、5.20%、5.36%、5.12%、3.48%；隨著保壓時間的延長峰值逐漸變小，蛋白α-螺旋含量也逐漸變小。150 MPa處理10 min時α-螺旋含量最大，為14.66%；隨著壓力的增大，α-螺旋含量逐漸降低。蛋白質的二級結構是由多肽鏈借助氫鍵沿著某個軸盤旋或折疊形成的規則性和有周期性結構的構象，主要表現為α-螺旋、β-折疊、β-轉角及無規卷曲結構[21]。相關研究表明，α-螺旋結構對壓力處理比較敏感[22]，與本研究結果一致。主要原因是HHP處理影響蛋白質結構氫鍵的穩定性，氫鍵又是影響蛋白二級結構構象穩定性的重要因素，蛋白質的α-螺旋結構主要是靠多肽鏈上羰基（—C＝O）和氨基（—NH2）之間的氫鍵維持[23-24]。

2.4 HHP處理后肌原纖維蛋白激光拉曼光譜分析

圖7 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min激光拉曼光譜Fig.7 Laser Raman spectra of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

圖8 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白激光拉曼光譜Fig.8 Laser Raman spectra of myof i brillar proteins treated for different durations at 300 MPa

如圖7、8所示，酰胺I帶集中在約1 650 cm－1處，其是蛋白質二級結構的特殊表征[27]。有研究表明，在1 600～1 700 cm－1處的酰胺I帶與蛋白骨架構象類型相關[28]。α-螺旋結構集中在1 650～1 660 cm－1處，β-折疊結構集中在1 665～1 680 cm－1處，無規卷曲集中在1 660～1 665 cm－1處[29]。肌原纖維蛋白激光拉曼光譜的指認見表1。研究表明，隨著壓力的增加，蛋白α-螺旋結構不斷減少，β-折疊或者無規卷曲增加，其二級結構間的轉化表明蛋白氫鍵的重排，CD結果也證明了這一點，與Choi等[30]的研究結果相符。

表1 激光拉曼光譜條帶指認[25-26]Table1 Attribution of Raman bands[25-26]

2.5 不同壓力處理肌原纖維蛋白掃描電子顯微鏡觀察結果

圖9 不同壓力處理肌原纖維蛋白10 min掃描電子顯微鏡圖Fig.9 Scanning electron microscopic analysis of myof i brillar proteins treated with different pressures for 10 min

如圖9所示，不同壓力處理養殖大黃魚魚肉肌原纖維蛋白的微觀結構存在明顯的差別。未處理組蛋白表面沒有孔洞，結構平整、致密。經HHP處理后蛋白表面逐漸出現孔洞，300 MPa處理時蛋白表面的孔洞均勻，結構松散、均勻；350 MPa處理時蛋白表面形成較大的孔洞，凝膠組織呈絮狀，結構松散、均勻；壓力為400 MPa時結構出現坍塌；當壓力增大到500 MPa時，蛋白結構呈纖維狀。這可能是由于HHP誘導蛋白發生均勻變性，蛋白聚合形成空間立體的凝膠網狀結構造成的[31]。蛋白微觀結構的變化可能是由于一定的壓力條件改變了蛋白分子內和分子間作用力，破壞了蛋白結構[32]。這與傅里葉變換紅外光譜、CD、拉曼光譜的分析結果一致，蛋白表面形成的孔洞使水分子與蛋白的接觸面積大幅增加，引起大量氨基酸殘基的化學環境發生改變，增大了蛋白分子內部疏水性位點的暴露程度，影響了蛋白質結構氫鍵的穩定性，維持蛋白α-螺旋結構的羰基（—C＝O）和氨基（—NH2）之間的氫鍵被破壞，羰基與水分子形成新的氫鍵，因此壓力對肌原纖維蛋白的結構影響較大[33]。

圖10 不同保壓時間300 MPa處理肌原纖維蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig.10 Scanning electron microscopic images of myof i brillar protein treated for different durations at 300 MPa

如圖10所示，蛋白表面的網狀結構隨著保壓時間的改變而改變。隨著保壓時間的延長，蛋白網狀結構更加明顯。當保壓10 min時，蛋白孔隙均勻，組織呈絮凝狀，結構松散、均勻；保壓20 min時，蛋白表面孔洞較大，組織呈絮凝狀，結構松散、不均勻；之后隨著保壓時間的延長蛋白表面不再有網狀結構，但300 MPa處理30 min蛋白呈較為緊湊的纖維結構。微觀結構的改變使蛋白質的表面疏水性變大，溶解性降低，這與表面疏水性的研究結果一致。蛋白微觀結構的變化與其保壓時間密切相關，壓力改變了蛋白分子內和分子間作用力，破壞了蛋白結構，這與付強[34]的研究結果相似。HHP處理促進養殖大黃魚肌原纖維蛋白的變性，壓力越大、保壓時間越長其變性程度越大，變性程度直接影響著肌原纖維蛋白的微觀結構。

3 結 論

養殖大黃魚肌原纖維蛋白經HHP處理，蛋白二級結構、三級結構均發生改變。HHP處理使蛋白中色氨酸殘基移動并暴露在其外部的極性環境；使水分子進入蛋白分子內部，使大分子內部結構發生一系列變化，其中α-螺旋含量隨壓力的升高和保壓時間的延長而逐漸降低。蛋白質微觀結構的變化是導致養殖大黃魚魚肉表觀特性改變的重要原因，有研究表明，經HHP處理的蛋白質在持水性[35]、溶解性[36]、乳化性[37]、表面疏水性[38]、熱穩定性[39]、巰基含量[40]等方面都有顯著變化，這可能都與蛋白結構變化有關。