超高壓對醬鹵羊肚感官品質、微觀結構及其肌漿蛋白特性的影響

劉楊銘，侯 然，趙 偉，盧士玲，王慶玲，李文慧，董 娟,*

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214000）

新疆羊產業發展迅速，是羊肉消費大省[1-2]。在羊肉的屠宰和加工中，副產物的浪費會對經濟和生態環境等造成一定的消極影響[3]。羊肚為綿羊（或山羊）的胃，屬平滑肌肉類，其中含有蛋白質、脂肪、碳水化合物和維生素等多種營養物質，又具有益氣補虛、健脾健胃的功效，是一種新興的保健食品。

與常見牛肚類食物相同，羊肚烹飪手法多樣[4]，其中醬鹵羊肚因具有色香、味美、肉質鮮嫩的特點而深受人們喜愛。但目前市售的醬鹵羊肚多未經二次殺菌散裝出售，使其品質在貯藏過程中發生急速且嚴重的下降；而傳統熱殺菌較高的溫度又會造成脂肪、蛋白質等營養成分的損失，其感官品質也會隨之下降[5]。超高壓（ultra high pressure，UHP）為一種新型的非熱加工技術，在滅菌的同時，蛋白質發生變性或降解，但其一級結構不改變，食品本身的新鮮度、感官特性及營養成分也幾乎不會受到影響；且UHP處理是純物理過程，操作簡便、能耗低，不會對生態環境造成惡劣影響，因有效避免了傳統熱殺菌的弊端而備受關注[5-8]。

肌漿蛋白是肉中最易提取的蛋白質，在肉類食品的加工貯藏及形成風味物質的過程中發揮著重要的作用[9]。目前，已有關于UHP對禽、畜肉品改性作用[10-11]、UHP對牛骨骼肌肌肉蛋白質的影響[12]和UHP對牛副產物食品開發、改良及殺菌效果[13-14]的報道，但該技術對平滑肌肉類食品中蛋白質影響的研究還鮮見報道；因此，本研究針對這一問題進行探討，采用UHP技術對醬鹵羊肚進行二次殺菌，研究其對醬鹵羊肚感官品質及肌漿蛋白特性的影響，以期在開發新型肉制品時為指導生產過程、合理選擇工藝參數提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮綿羊羊肚購于石河子市牛羊定點屠宰場。剖開羊肚并將內容物倒出，撕除表面油脂及雜物（血管、肚膜等），流水沖洗，切成10 cmh2 cm的長條狀備用。老抽、食鹽、料酒、雞精、八角、小茴香、花椒、干辣椒、香葉、胡椒、干姜、桂皮均購于石河子市好家鄉超市。

尿素 天津永晟精細化工有限公司；2,4-二硝基苯肼 天津市風船化學試劑科技有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 天津市北聯精細化學品開發有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）、鹽酸胍 北京博奧拓達科技有限公司；甘氨酸 美國Amresco公司；溴酚藍 上海試劑三廠。

1.2 儀器與設備

DZ-400/2C真空包裝機 上海青浦食品包裝機械廠；T25 digital ULTRA-TURRAX高速分散器 艾卡（廣州）儀器設備有限公司；Multifuge X1R高速冷凍離心機賽默飛世爾科技（中國）有限公司；EONC酶標儀美國伯騰儀器有限公司；MOS-450/AF-CD圓二色光譜儀法國Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將鹵制并真空包裝好的羊肚放入UHP處理腔中，傳壓介質為蒸餾水，將其溫度控制在室溫（25 ℃），壓力水平控制在100、250、400 MPa，保壓時間控制在5、10、15、20、25 min，進行UHP處理。升壓至所需壓力后開始計保壓時間，保壓時間達到后機器自動迅速卸壓。未經UHP處理的樣品為空白樣品。取出經UHP處理后的樣品并迅速置于冰水中冷卻，于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 UHP處理醬鹵羊肚感官評價

感官評定參考Sallam[15]的方法進行，由20 位具有感官評定知識且自身健康的食品專業的老師與學生組成感官評定小組，小組全體成員在同一時間分別對樣品進行感官評價，相互之間無任何交流。將醬鹵羊肚放在單獨且無菌的一次性餐盤中，每位成員在評價不同樣品時以溫水漱口，以免受到樣品之間的影響。評價的內容包括顏色、口感、香味和滋味。具體評分標準見表1。

表1 醬鹵羊肚的感官評分標準Table1 Criteria for sensory evaluation of sauced sheep stomach

1.3.2.1 壓力水平對醬鹵羊肚感官評分的影響

按照1.3.1節的方法制備醬鹵羊肚并進行UHP處理，其中保壓時間為15 min，保壓溫度為30 ℃，壓力水平分別為100、200、300、400、500 MPa，按照1.3.2節方法進行感官評定。

1.3.2.2 保壓時間對醬鹵羊肚感官評分的影響

按照1.3.1節的方法制備醬鹵羊肚并進行UHP處理，其中壓力水平為300 MPa，保壓溫度為30 ℃，保壓時間分別為5、10、15、20、25 min，按照1.3.2節方法進行感官評定。

1.3.2.3 保壓溫度對醬鹵羊肚感官評分的影響

按照1.3.1節的方法制備醬鹵羊肚并進行UHP處理，其中壓力水平為300 MPa，保壓時間為15 min，保壓溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，按照1.3.2節方法進行感官評定。

1.3.3 微觀結構的觀察

醬鹵羊肚微觀結構的觀察參考趙偉等[16]的方法。

1.3.4 肌漿蛋白的提取

以醬鹵羊肚中提取的肌漿蛋白為蛋白樣品，提取方法參考文獻[17]并略有改動。取一定量的醬鹵羊肚，剔除可見脂肪和結締組織，切碎后稱取10 g于離心管中，按料液比1∶2加入0.03 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液，12 000 r/min勻漿15 s。勻漿液在4 ℃ 5 000 r/min離心15 min，收集上清液，此步驟重復2 次，上清液即為肌漿蛋白溶液，于4 ℃保存備用。采用Biuret法測定醬鹵羊肚中肌漿蛋白質量濃度。

1.3.5 羰基含量的測定

羰基含量參考李艷青[18]的方法進行測定，略有改動。取2 mL蛋白樣品溶液放入直徑2.5 cm離心管中，每管中加入2 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼，室溫下反應1 h（每10 min漩渦振蕩1 次）后，添加5 mL質量分數20%三氯乙酸，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，用1 mL體積比為1∶1的無水乙醇-乙酸乙酯混合溶液清洗沉淀3 次，除去多余的試劑，向沉淀中加入3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液后置于37 ℃水浴鍋中15 min將沉淀溶解，5 000 r/min離心10 min除去不溶物質，取離心后的上清液在370 nm波長處測吸光度。按公式（1）計算羰基含量。

式中：A為370 nm波長處的吸光度；ε為摩爾吸光系數（22 000 L/（molgcm））；b為比色皿寬度/cm；c為羰基含量/（nmol/mg）。

1.3.6 總巰基含量的測定

總巰基含量考Yongsawatdigul等[19]的方法進行測定。取1 mL蛋白樣品溶液，加入8 mL Tris-甘氨酸（每升該溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g EDTA、8 mol/L尿素，pH 8），經均質、5 000 r/min離心15 min除去不溶蛋白，再在溶液中加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，以不含Ellman試劑的溶液為空白，反應0.54 h后在412 nm波長處測定吸光度，總巰基含量按公式（2）計算。

式中：A為412 nm波長處的吸光度；ε為摩爾吸光系數（13 600 L/（molgcm））；b為比色皿寬度/cm；c為總巰基含量/（nmol/mg）。

1.3.7 游離氨基比例的測定

游離氨基比例根據Brands等[20]的報道，采用鄰苯二甲醛（O-phthalic aldehyde，OPA）法進行測定。準確稱取40 mg OPA溶解于1 mL甲醇中，加入2.5 mL 20%十二烷基硫酸鈉、25 mL 0.1 mol/L硼砂和100 μL β-巰基乙醇后用蒸餾水定容至50 mL。將200 μL蛋白樣品溶液分別注入含有4 mL空白液和4 mL OPA溶液的試管中，混合均勻后在35 ℃下反應2 min，以不加入蛋白樣品溶液為空白，并分別測定其在340 nm波長處的吸光度A340nm和A未氧化，二者之差為ΔA340nm。游離氨基比例按公式（3）計算。

1.3.8 溶解度的測定

溶解度的測定參考Xiong Youling L.等[21]的方法并略有改動。用去離子水將肌漿蛋白稀釋到1 mg/mL，5 000 r/min離心20 min，測定離心后上清液蛋白質量濃度。溶解度按公式（4）計算。

1.3.9 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定參考李艷青[18]的方法，略有改動。向1 mL蛋白質樣品溶液中加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液，混勻后于室溫下攪拌10 min，5 000 r/min離心15 min，取上清液在595 nm波長處測定吸光度A。向1 mL 20 mmol/mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）中加入200 μL溴酚藍溶液，以磷酸鹽緩沖液作為空白，在595 nm波長處測定吸光度A0。蛋白質的表面疏水性以和蛋白質結合的溴酚藍質量表示，如式（5）所示計算。

1.3.10 濁度的測定

濁度的測定參考Xiong Youling L.等[21]的方法。用去離子水將肌漿蛋白稀釋到1 mg/mL，40 ℃保溫30 min，快速冷卻后測定肌漿蛋白溶液在320 nm波長處的吸光度，根據吸光度的大小判斷濁度。

1.3.11 肌漿蛋白二級結構的測定

將肌漿蛋白質量濃度調整到0.01～0.20 g/L，以磷酸鹽緩沖液為空白，采用MOS-450/AF-CD圓二色光譜儀在遠紫外區（190～250 nm）掃描，樣品池光程為1 mm，掃描速率30 nm/min，分辨率為0.1 nm，靈敏度為20 mdeg，響應時間為2 s，25 ℃下扣除溶液空白影響，重復掃描3 次，累加得到遠紫外圓二色光譜圖譜，用計算機模擬得到α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲含量。

1.4 數據統計與分析

每組實驗重復3 次，實驗結果采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin Pro 8.5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 UHP處理對醬鹵羊肚感官評分的影響

由圖1A可知，在壓力水平為100～400 MPa時，醬鹵羊肚的感官評分呈上升趨勢，并于400 MPa時達到最高；在壓力水平為500 MPa時感官評分下降。這可能是因為過高的壓力造成醬鹵羊肚的化學成分發生過度的變化，風味物質發生改變，組織結構被破壞。由圖1B可知，醬鹵羊肚的感官評分隨保壓時間的延長而逐漸提高，在保壓時間為20～25 min時感官評分趨于平穩，可能是該條件下，UHP處理使其中各營養成分發生了充分的化學變化，醬鹵羊肚的質構得到改善。由圖1C可知，在20～25 ℃時，醬鹵羊肚的感官評分提高，并于25 ℃時達到最高，之后逐漸降低，這可能是由于較高的溫度使其脂肪、蛋白質等營養成分發生了過度的化學變化，造成色澤、嫩度等的破壞[5]，從而影響其感官評分。故25 ℃為UHP處理醬鹵羊肚的適宜保壓溫度。

圖1 UHP處理對醬鹵羊肚感官評分的影響Fig.1 Effect of UHP treatment on sensory score of sauced sheep stomach

2.2 UHP處理對醬鹵羊肚微觀結構的影響

圖2 UHP處理條件下醬鹵羊肚微觀結構的變化（2 000×）Fig.2 Change in the microstructure of sauced sheep stomach after UHP treatment (2 000 ×)

由圖2可知，對照組（圖2A）醬鹵羊肚肌纖維間膠束較多，表面網狀結構結實致密，間隙小而均勻；當壓力水平為100 MPa時，隨著時間的延長，醬鹵羊肚表面逐漸呈現出多孔、疏松的網狀結構；當壓力水平為250 MPa和400 MPa時，醬鹵羊肚表面的肌纖維結構逐漸消失，表面模糊，紋理不清晰；長時間UHP處理的醬鹵羊肚網狀結構明顯減少，膠束的聚集程度增加、間隙變大，且更加不均勻，形成了眾多大小不一的蛋白聚集膠束。說明壓力造成了蛋白質變性。適度的UHP處理使醬鹵羊肚的顏色、質構得到改良，表現為感官評分提高，這與2.1節中200～400 MPa處理醬鹵羊肚的感官評分提高的結果一致。

造成以上現象的原因可能是：較低的壓力水平導致酶與基質接觸，加速了酶促反應的發生，樣品肌肉中蛋白質的溶解度增加，顯示出肌肉纖維結構的破壞[16]；隨著壓力的增加，蛋白質發生變性，其中的部分自由水溶出，導致其結構的界限變得不再明顯，相互之間結合更加緊密。可見，UHP處理的壓力水平和保壓時間對最終的微觀結構都起著很大的影響。尤其在高壓力水平條件下，膠束變得更加粗糙，形狀不規則，間隙大而不均勻，類似變性蛋白顆粒的聚集體。

2.3 UHP處理對醬鹵羊肚羰基含量的影響

如圖3所示，與對照組（0 min）相比，樣品經過UHP處理后肌漿蛋白中的羰基含量呈上升趨勢。在各壓力水平下，5～10 min內，羰基含量出現小幅度的下降，說明此時間內蛋白質發生氧化變性的程度較低。當保壓時間達到25 min時，蛋白質發生過度的氧化變性，100、250、400 MPa 3 個壓力水平下肌漿蛋白的羰基含量分別增加了36.58%、25.60%和41.68%，此時產品的感官評分相對較高。這與2.1節的結果一致。蛋白質發生氧化變性的一個顯著特征是形成了羰基基團，因其測定方法簡便而被廣泛地用于評價蛋白質發生氧化變性的程度。羰基基團主要通過以下4 種途徑產生[22]：氨基酸殘基側鏈被氧化；肽骨架的斷裂；與還原糖發生反應；結合非蛋白羰基化合物。結果表明，構成蛋白質分子的肽鏈骨架因UHP處理而發生斷裂，從而導致醬鹵羊肚肌漿蛋白中羰基含量的增加。

圖3 UHP處理條件下羰基含量的變化Fig.3 Change in carbonyl group content in UHP-treated sarcoplasmic protein

2.4 UHP處理對醬鹵羊肚總巰基含量的影響

圖4 UHP處理條件下總巰基含量的變化Fig.4 Change in total mercapto group content in UHP-treated sarcoplasmic protein

蛋白質中含有許多疏水基團和巰基（—SH），UHP處理可使巰基暴露于分子表面，從而形成二硫鍵（—SüS—），所以巰基含量可以作為反映蛋白氧化變性的一個重要指標。如圖4所示，總巰基含量受UHP處理的影響同羰基含量的變化趨勢相反。在相同壓力水平下，總巰基含量隨保壓時間的延長而減少。將樣品在100、250、400 MPa壓力下分別進行處理，當保壓時間為5 min時，僅有少量的疏水基團和巰基受高壓的影響暴露于表面，蛋白質分子鏈未能完全伸展，分子柔性較小，感官品質不佳；當保壓時間達到25 min時，100、250、400 MPa壓力處理肌漿蛋白的巰基含量分別減少了30.07%、27.05%和32.82%。造成此現象的原因可能是，壓力狀態下蛋白質發生過度的氧化變性，導致蛋白質分子被完全打開，大量巰基暴露在蛋白質分子的表面，與可溶性小分子聚合物發生凝聚，造成肌纖維膠束緊密，肉質變硬、彈性變差[23]。以上結果表明，總巰基含量會隨著UHP處理條件的改變而發生變化，但都表現出在較長保壓時間下總巰基含量減少的趨勢。

2.5 UHP處理對醬鹵羊肚游離氨基比例的影響

圖5 UHP處理條件下游離氨基比例的變化Fig.5 Change in free amino group content of UHP-treated sarcoplasmic protein

如圖5所示，與對照組相比，每組樣品的游離氨基比例都發生了下降，對照組肌漿蛋白游離氨基比例為52.48%，樣品經過100、250、400 MPa處理25 min后，游離氨基比例分別下降53.06%、44.41%和63.99%。游離氨基比例的下降可能是由于側鏈中含有—NH或—NH2的氨基酸參與了羰基的形成[24]。

2.6 UHP處理對醬鹵羊肚肌漿蛋白二級結構變化的影響

圖6 UHP處理對肌漿蛋白二級結構的影響Fig.6 Effect of UHP on the secondary structure of UHP-treated sarcoplasmic protein

圓二色光譜法是研究蛋白質二級結構的重要手段。由圖6可知，與對照組相比，UHP處理造成蛋白質二級結構改變，其中對α-螺旋和β-折疊含量的影響較大。α-螺旋含量從21.6%增加至37.3%；β-折疊含量從24.0%減少至9.1%（圖6A）；而對β-轉角和無規卷曲的含量影響不大，最終形成了以α-螺旋和無規卷曲為主的二級結構。這與Bouraoui等[25]的研究結果不一致，可能是由于β-折疊中肽段及肽鏈間的氫鍵受到UHP的破壞而形成氨基酸殘基，最終以α-螺旋的形式存在。

2.7 UHP處理對醬鹵羊肚肌漿蛋白溶解性的影響

肌漿蛋白溶解性對肉的品質有重要的指示作用。Kolczak等[26]對31 個不同品質的豬肉樣品進行研究，結果表明白肌肉中肌漿蛋白的溶解性最低，不能作為提取肌漿蛋白的材料。

圖7 UHP處理對肌漿蛋白溶解性的影響Fig.7 Change in the solubility of UHP-treated sarcoplasmic protein

如圖7所示，UHP處理導致肌漿蛋白的溶解性降低，且隨保壓時間的延長呈現出整體下降的趨勢。與對照組相比，經100、250、400 MPa處理25 min時，肌漿蛋白的溶解度分別降低了44.65%、37.06%、45.62%。結果表明，UHP處理在很大程度上使蛋白溶解性降低，其降低程度與UHP處理條件密切相關。100～400 MPa范圍內，壓力水平對蛋白質溶解性的影響大小為：400 MPa＞100 MPa＞250 MPa。UHP處理造成蛋白質溶解度增加的原因可能是，超高的壓力造成蛋白質分子及其多肽逐漸解旋，后聚集成為許多小顆粒的亞基單元，極性基團和疏水基團的暴露導致蛋白質表面的電荷分布增強，與水分子結合后造成蛋白質的水化作用增強，因此蛋白質在水中的溶解度增加[27]。

2.8 UHP處理對醬鹵羊肚表面疏水性的影響

在許多關于蛋白質的研究中，表面疏水性已經成為評價蛋白質發生氧化變性的一項重要指標，通常認為造成蛋白質表面疏水性增加的主要原因是埋藏在蛋白質分子內部的疏水基團的暴露。

由圖8可知，UHP處理后樣品的肌漿蛋白表面疏水性增加，這與Morzel等[27]的研究結果一致。出現這種情況的原因可能是，受到UHP處理的影響，蛋白質的構象發生變化，內部的一些疏水性基團暴露于蛋白質分子表面，導致蛋白質的表面疏水性增加。

圖8 UHP處理后肌漿蛋白表面疏水性的變化Fig.8 Change in surface hydrophobicity of UHP-treated sarcoplasmic protein

2.9 UHP處理對醬鹵羊肚濁度的影響

表2 UHP處理后蛋白質濁度的變化Table2 Change in the turbidity of the protein after UHP treatment

濁度可用來表征蛋白質的聚集程度。如表2所示，經UHP處理后，蛋白質樣品的濁度發生不同程度的增加，且濁度發生變化的程度與UHP處理的壓力和時間是相關的。與對照組相比，同一壓力水平下，肌漿蛋白的濁度隨保壓時間的延長而呈現增加的趨勢，至20～25 min時，各壓力下肌漿蛋白的濁度大小趨于同一水平。壓力水平對濁度造成影響的大小為：400 MPa＞100 MPa＞250 MPa。肌漿蛋白濁度的增加可能是由于樣品經UHP處理后，肌漿蛋白巰基氧化形成二硫鍵，溫度又使其產生聚集造成的。

3 結 論

本實驗以醬鹵羊肚及其肌漿蛋白為研究對象，設置不同UHP處理條件，研究UHP處理對醬鹵羊肚感官品質、微觀結構及其肌漿蛋白的影響，結果表明：UHP處理可導致肌漿蛋白發生氧化變性，使蛋白質的羰基含量、濁度和表面疏水性增加，而總巰基含量、游離氨基比例、溶解性降低，其二級結構中α-螺旋和β-折疊含量受UHP處理影響較大；不同壓力水平、保壓時間和保壓溫度對醬鹵羊肚的感官品質影響明顯。UHP處理使醬鹵羊肚的微觀結構發生變化，高壓力水平條件下，肌纖維表面膠束粗糙、形狀不規則、間隙變大而不均勻，400 MPa、25 ℃ UHP處理20 min導致蛋白質發生適度的氧化變性，會使醬鹵羊肚的顏色、口感、香味、滋味等得到改善，從而提高其感官品質。