芹菜素對3-氯-1,2-丙二醇誘導的大鼠腎損傷及線粒體分裂融合的影響

鐘玉杰，師振強，晉程妮，王曉瑞，李 璇，韓佳慧，薛 維，伍 鵬，彭曉麗*，夏效東*

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

氯丙醇類化合物是目前國際上廣為關(guān)注的食品污染物，其中3-氯-1,2-丙二醇（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD）因其污染大、毒性強，被視為氯丙醇類化合物的代表和毒性參考物[1]。高鹽、高脂食品在熱加工過程中極易產(chǎn)生此種化合物[2]。3-MCPD易溶于水和脂，經(jīng)消化道吸收后，可隨血液循環(huán)分布于機體各個組織和臟器中，其中腎臟和雄性生殖系統(tǒng)是其主要靶器官[3]。最初，3-MCPD在酸水解蛋白加工的醬油中被發(fā)現(xiàn)[4]，另外，熱加工食品嬰幼兒配方奶粉中也含有一定量的3-MCPD[5-7]。3-MCPD對嚙齒類動物的毒性較大，世界衛(wèi)生組織的技術(shù)性報告初步發(fā)現(xiàn)劑量為30 mg/kg的3-MCPD可引起大鼠腎小管擴張壞死并可能引發(fā)腎小管病變、腎小管增生等現(xiàn)象[8]。Cho等研究發(fā)現(xiàn)用400 mg/L 3-MCPD處理時，雄性和雌性大鼠腎小管腺瘤、腎小管增生和慢性進行性腎病顯著增加[9]。鑒于3-MCPD分布的廣泛性及其對機體的毒害效應，尋求更多能夠緩解3-MCPD毒性的天然活性物質(zhì)具有現(xiàn)實意義。

芹菜素是一種天然存在的黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜和草藥中，尤其在芹菜根中含量最高（高達74 mg/kg）[10]。芹菜素可通過調(diào)節(jié)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量及谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平發(fā)揮其抗氧化效果從而緩解紅藻氨酸誘導的老鼠體內(nèi)及體外興奮毒性[11]。給結(jié)腸炎大鼠模型灌胃芹菜素，結(jié)果顯示芹菜素預處理組的大鼠結(jié)腸質(zhì)量下降了10%，結(jié)腸髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和堿性磷酸酶活性分別下降了35%和21%，炎性標記物腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等也趨于正常表達[12]。以脂多糖誘導的原代培養(yǎng)SD大鼠的主動脈平滑肌細胞為研究對象，20、40 μmol/L芹菜素可抑制細胞有絲分裂使細胞停滯于G0/G1期，從而抑制細胞增殖[13]。Fu等[14]的研究表明芹菜素逆轉(zhuǎn)了TNF-α導致的B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）的減少和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）的增加，降低了Caspase 3的活性從而抑制了TNF-α誘導的細胞凋亡。另外，芹菜素能緩解神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥的發(fā)生和發(fā)展[15-16]。以上研究表明，芹菜素具有抗炎、抗氧化、心血管保護、神經(jīng)保護、抑制藥物誘導的細胞凋亡性死亡等多種生理作用。

線粒體是高度動態(tài)化的管狀互連網(wǎng)絡，維持這種涉及線粒體分裂 、融合及蠕動的復雜網(wǎng)狀組織對線粒體和細胞功能的實現(xiàn)非常重要[17]。當線粒體融合分裂動態(tài)平衡被破壞或線粒體相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子異常表達時，會引發(fā)多種臟器損傷，尤其是富含線粒體的腎臟。Qin Shuangli等[18]發(fā)現(xiàn)氟中毒大鼠腎組織中MFN1表達水平降低，同時FIS1表達水平升高，從而導致了腎臟近曲小管上皮細胞線粒體形態(tài)紊亂。Gall等[19]發(fā)現(xiàn)敲除MFN2的小鼠腎小管上皮細胞線粒體融合降低，引發(fā)了Bax的激活和細胞色素c的釋放。膿血癥致腎損傷大鼠模型中PGC1表達量下降，而PGC1轉(zhuǎn)基因小鼠的缺血耐受力增強[20]。由以上文獻知，線粒體分裂融合狀態(tài)與腎臟損傷有著直接或間接的聯(lián)系。目前鮮見關(guān)于3-MCPD誘導線粒體分裂融合異常的相關(guān)報道，也鮮有用芹菜素緩解大鼠腎毒性的相關(guān)研究。本實驗基于線粒體分裂融合、轉(zhuǎn)錄因子表達水平的變化，探討芹菜素對3-MCPD誘導的大鼠腎損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級健康干凈的雄性SD大鼠（（200f10）g），購自西安交通大學醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK2013-003。

3-MCPD（純度98%） 北京百靈威科技有限公司；芹菜素（純度98%） 南京春秋生物工程有限公司；超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA Synthesis試劑盒、UitraSYBR Mixture試劑盒、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗 康為世紀生物科技有限公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC） 美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒、蘇木精-伊紅染色試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗（FIS1、NRF1、MFN2、ACTB） 美國Proteintech公司。

1.2 儀器與設備

垂直電泳槽、垂直電泳儀配套梳子、基礎電泳儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)、IQ5實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國伯樂公司；定軌搖床 海門市其林貝爾儀器；核酸蛋白測定儀 杭州奧盛儀器；SXD-100D數(shù)碼倒置顯微鏡上海蔡康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

將36 只SD大鼠按體質(zhì)量隨機分為6 組，每組6 只。動物在空氣相對濕度60%～70%、溫度（20f2）℃的動物房中適應性生長1 周，期間大鼠可自由攝食、飲水，明暗交替時間為12 h。1 周后進行灌胃處理：對照組灌胃超純水；溶劑對照組灌胃CMC；3-MCPD組灌胃30 mg/kg mb3-MCPD；芹菜素低、中、高劑量組先分別灌胃20、40、80 mg/kg mb芹菜素，2 h 后再灌胃30 mg/kg mb3-MCPD。芹菜素先用質(zhì)量分數(shù)1% CMC溶液懸浮，然后用超純水進行相應稀釋，確保每只大鼠攝入CMC的量一致；3-MCPD用超純水溶解。

每天記錄大鼠的飲水量和進食量。灌胃28 d后，處死大鼠，解剖取其腎臟、肝臟、腦組織，用預冷的生理鹽水沖洗組織，濾紙吸干臟器上殘留水分，天平稱質(zhì)量，計算各臟器質(zhì)量指數(shù)。將組織保存在－80 ℃冰箱中。

1.3.2 臟器質(zhì)量指數(shù)

肝臟、腎臟、腦組織質(zhì)量指數(shù)按以下公式計算。

1.3.3 腎臟組織病理學分析

用蘇木精和伊紅染色觀察腎臟組織的病理變化。用質(zhì)量分數(shù)1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，用生理鹽水和質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛進行心臟灌注。取出右腎，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)脫水透明后包埋在石蠟中，然后用質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛洗滌兩次。切片脫蠟后，分別用蘇木精染色7 min，伊紅染色1 min，樹脂封片后，在數(shù)碼倒置顯微鏡下放大100 倍進行觀察。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測基因表達

用超純RNA提取試劑盒提取腎組織總RNA，微量核酸和蛋白質(zhì)的定量儀測定其質(zhì)量濃度。根據(jù)HiFiScript cDNA Synthesis試劑盒指示將9 μL總RNA樣品轉(zhuǎn)化為cDNA，反應體系為20 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用nano drop核酸蛋白測定儀檢測濃度并調(diào)整質(zhì)量濃度為100 ng/μL。用UitraSYBR Mixture染料，實時PCR檢測系統(tǒng)測定mRNA的表達量。PCR循環(huán)參數(shù)：預變性 95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 1 min，延伸60 ℃ 1 min，循環(huán)40 次。基因相對表達量用2－ΔΔCt法計算。實時熒光定量PCR引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table1 Primer sequences used in this study

1.3.5 Western blot檢測蛋白表達

稱取約30 mg組織，剪碎于10 mL離心管中，加入500 μL含體積分數(shù)1%的100 mmol/L PMSF溶液，勻漿20 次后在冰上放置30 min使之充分裂解，13 400hg離心5 min，吸取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒來檢測未知樣品中蛋白的含量。將變性后的蛋白樣品用SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，然后在100 V、0.3 A的條件下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含質(zhì)量分數(shù)5%脫脂奶粉的封閉液在室溫下均勻振蕩孵育2 h，一抗孵育過夜，棄去一抗，TBST洗3 次，每次20 min，隨后用HRP標記的二抗于室溫振蕩條件下孵育2 h，棄去二抗，TBST洗3 次，每次20 min。將超敏ECL化學發(fā)光試劑盒中A液與B液等體積混合后，滴在膜上，經(jīng)化學發(fā)光系統(tǒng)顯色后用圖像分析軟件ImageJ計算灰度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，結(jié)果采用平均值±標準差表示。組間比較采用Duncan法，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，均具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜素對3-MCPD致腎損傷大鼠體質(zhì)量、攝食量的影響

由圖1可見，與對照組相比，灌胃一周后，3-MCPD組大鼠食欲開始下降，28 d時3-MCPD組大鼠攝食量降低。隨著灌胃時間的延長，相較3-MCPD處理組，芹菜素保護組大鼠食物攝入量增加，灌胃14 d后芹菜素保護組大鼠的食物攝入量均高于3-MCPD組。結(jié)果提示芹菜素能顯著改善3-MCPD組大鼠精神萎靡、食欲不振、生長遲緩等狀況。

圖1 3-MCPD、芹菜素和3-MCPD協(xié)同處理后大鼠攝食量（A）、體質(zhì)量（B）變化（n ＝5）Fig.1 Changes in food intake (A) and body mass (B) of rats after treated with 3-MCPD alone or in combination with apigenin (n = 5)

2.2 芹菜素對3-MCPD致腎損傷大鼠腎臟、肝臟、腦質(zhì)量指數(shù)的影響

由圖2可知，相較對照組，3-MCPD組大鼠腎臟質(zhì)量極顯著增加（P＜0.01）、肝臟質(zhì)量指數(shù)也有所增加（P＜0.05）。芹菜素保護組大鼠腎臟質(zhì)量指數(shù)均低于3-MCPD組，其中高劑量芹菜素保護組腎臟質(zhì)量指數(shù)與3-MCPD組相比差異極顯著（P＜0.01）。對于肝臟質(zhì)量指數(shù)，芹菜素保護組較3-MCPD組無明顯差異。由腦質(zhì)量指數(shù)可知，3-MCPD組、芹菜素保護組腦質(zhì)量指數(shù)與對照組相比無明顯變化。通過以上臟器比指數(shù)知，腎組織對3-MCPD敏感，這與腎臟是3-MCPD的靶器官的研究一致。由此可知，芹菜素以劑量依賴性地方式緩解了3-MCPD對大鼠腎組織的毒害作用。

圖2 3-MCPD、芹菜素和3-MCPD協(xié)同處理后大鼠腎臟（A）、肝臟（B）、腦（C）質(zhì)量指數(shù)Fig.2 Changes in renal/body mass ratio (A), liver/body mass ratio (B),and brain/body mass ratio (C) of rats subjected to 3-MCPD and 3-MCPD plus apigenin treatment

2.3 不同處理組大鼠腎臟組織病理學分析

圖3 大鼠腎臟組織病理學分析Fig.3 Histopathological analysis of rat kidney tissues

由圖3病理組織切片可知，對照組的腎組織無明顯異常，CMC組除腎小球毛細血管輕度出血外，也未發(fā)現(xiàn)其他明顯病變。與對照組相比，3-MCPD處理組的大鼠腎組織集合管上皮細胞排列不齊，發(fā)生水樣變性，胞體腫脹，胞漿淡染（紅色箭頭）；腎小球縮小，腎小囊變大（黑色箭頭）；腎小管上皮細胞數(shù)量減少，管腔中可見少量脫落的上皮細胞（綠色箭頭）；靜脈血管內(nèi)膜疏松、增厚（黃色箭頭）。低劑量芹菜素保護組中集合管上皮細胞排列不齊（黑色箭頭）；腎小管上皮細胞數(shù)量減少，胞漿嗜酸性增強（綠色箭頭）；腎小管管腔中可見多量紅色滴狀物（黃色箭頭）。由中劑量芹菜素保護組的病理切片可知，集合管上皮細胞排列不齊，輕微損傷，胞核居于一側(cè)（黑色箭頭）；腎小管部分上皮細胞胞核消失，呈空泡狀（黃色箭頭）。高劑量芹菜素保護組中集合管結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞排列較整齊。病理組織切片結(jié)果表明芹菜素在一定程度上緩解了3-MCPD誘導的腎損傷。

2.4 芹菜素對3-MCPD致腎損傷大鼠線粒體轉(zhuǎn)錄因子基因表達的影響

由圖4可見，與對照組相比，3-MCPD組大鼠線粒體合成相關(guān)基因PGC1、NRF1、TFAM表達顯著下調(diào)，分別降低了約76%、56%、38%（P＜0.01）。與3-MCPD處理組相比，芹菜素協(xié)同3-MCPD組的PGC1、NRF1、TFAM基因表達顯著上調(diào)，具有藥物依賴性，其中高劑量芹菜素協(xié)同處理組的PGC1從24%上升到116%，NRF1從44%上升到130%，TFAM從62%上升到100%（P＜0.01）。結(jié)果表明芹菜素協(xié)同處理能顯著改善3-MCPD導致的線粒體轉(zhuǎn)錄因子表達下降，這間接反映出芹菜素能維持線粒體正常結(jié)構(gòu)和功能。

圖 4 3-MCPD、芹菜素和3-MCPD協(xié)同處理后大鼠PGC1（A）、NRF1（B）、TFAM（C）基因表達Fig.4 Expression of PGC1 (A), NRF1 (B) and TFAM (C) genes in rats subjected to 3-MCPD and 3-MCPD plus apigenin treatment

2.5 芹菜素對3-MCPD致腎損傷大鼠分裂融合基因表達的影響

圖5 3-MCPD、芹菜素和3-MCPD協(xié)同處理后大鼠FIS1（A）、DRP1（B）、MFN1（C）、MFN2（D）基因表達情況Fig.5 Expression of FIS1 (A), DRP1 (B), MFN1 (C) and MFN2 (D)genes in rats subjected to 3-MCPD and 3-MCPD plus apigenin treatment

相較對照組，3-MCPD組MFN1基因下調(diào)表達約49%（P＜0.01），芹菜素保護組MFN1的基因表達量在3-MCPD組的基礎上顯著上調(diào)，其中高劑量芹菜素組的基因表達量增加了62%（P＜0.01）（圖5C）；與MFN1基因表達一致，3-MCPD處理組的MFN2基因下調(diào)表達約76%，高劑量芹菜素使受抑制的MFN2基因表達顯著回升，達到60%（P＜0.01）（圖5D）。與此相反，3-MCPD組大鼠線粒體分裂相關(guān)蛋白：FISI、DRP1基因表達較對照組、CMC組明顯增加，其中DRP1的基因表達量同對照組相比增加了1倍，芹菜素使3-MCPD導致的FISI、DRP1基因的上調(diào)表達回落（P＜0.01）（圖5A、B）。研究結(jié)果表明芹菜素緩解了3-MCPD導致的線粒體過度分裂和融合抑制，表明芹菜素有利于維持線粒體動態(tài)平衡、正常結(jié)構(gòu)和功能。

2.6 芹菜素對3-MCPD致腎損傷大鼠 NRF1、FISI、MFN2蛋白表達的影響

圖6 3-MCPD、芹菜素和3-MCPD協(xié)同處理后大鼠NRF1（A）、FIS1（B）、MFN2（C）蛋白表達情況Fig.6 Expression of NRF1 (A), FIS1 (B) and MFN2 (C) proteins in rats subjected to 3-MCPD and 3-MCPD plus apigenin treatment

蛋白表達結(jié)果與基因表達結(jié)果一致，相對于對照組，3-MCPD組的大鼠線粒體合成因子NRF1蛋白表達下調(diào)了40%，而芹菜素協(xié)同3-MCPD處理的大鼠NRF1蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖6A）。3-MCPD組線粒體分裂蛋白FIS1的蛋白表達量上調(diào)了63%，線粒體融合蛋白MFN2水平下調(diào)表達了約25%，高劑量芹菜素致使3-MCPD誘導的FIS1蛋白下調(diào)到112%，MFN2蛋白上調(diào)到120%（P＜0.01）（圖6B、C）。這表明芹菜素能保護大鼠免受3-MCPD引起的線粒體合成受阻、線粒體融合降低、線粒體分裂增加，從而保證線粒體功能的有效運轉(zhuǎn)。

3 討 論

肝臟、腎臟、腦組織水腫和肥大可以側(cè)面反映機體組織炎癥蔓延及損傷情況[21]。隨著灌胃劑量的增加與灌胃時間的延長，3-MCPD組SD雄性大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振癥狀，腎臟質(zhì)量指數(shù)、肝臟質(zhì)量指數(shù)顯著增加，其中腎臟質(zhì)量指數(shù)增加幅度最大為11%。表明3-MCPD導致了嚴重的腎損傷，這與腎臟是3-MCPD作用的靶器官結(jié)論一致。芹菜素協(xié)同3-MCPD處理組的大鼠精神狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)好，腎組織大小、腎臟質(zhì)量指數(shù)逐漸降低，其中，高劑量芹菜素保護組的腎質(zhì)量指數(shù)從0.43%下降到0.35%，說明芹菜素可緩解3-MCPD引起的大鼠腎損傷，且該保護作用呈劑量依賴性關(guān)系。

腎臟組織病理學檢查進一步證實了芹菜素對腎臟的保護作用。3-MCPD組的大鼠腎組織集合管、腎小球、腎小囊、腎小管均有不同程度的病變，另外，管腔中可見少量脫落的上皮細胞（綠色箭頭）；靜脈血管內(nèi)膜疏松、增厚（黃色箭頭）。而高劑量芹菜素與3-MCPD協(xié)同處理組腎組織集合管的結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞排列較整齊。

僅次于心臟，腎臟是線粒體含量第二豐富的臟器，其生理功能的正常行使依賴于能量供給，也就依賴于細胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定[22]。當大量線粒體損傷時，線粒體自噬途徑被激活，使得線粒體的數(shù)量不斷被消耗，為維持線粒體穩(wěn)定，細胞必須生成新的線粒體[23]。線粒體合成是一個復雜的過程，需要核基因組和線粒體基因組這兩套基因組的協(xié)調(diào)配合。PGC-1是調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關(guān)鍵性信號分子，然而當腎損傷發(fā)生時，PGC-1的表達被顯著下調(diào)表達[24]。3-MCPD顯著抑制了PGC1基因表達，其基因表達量下調(diào)了76%，然而芹菜素保護組PGC1表達量從24%增加到了116%，表明芹菜素對3-MCPD誘導的線粒體生物合成有一定的保護作用。作為PGC1的下游，線粒體合成時，NRF1被PGC1激活，NRF1可繼續(xù)激活TFAM[25]。3-MCPD腎損傷組NRF1、TFAM表達量皆顯著下調(diào)，而芹菜素組使NRF1表達量從44%增加到130%，TFAM表達量從62%增加到100%。芹菜素顯著緩解了3-MCPD組大鼠線粒體合成相關(guān)因子的下調(diào)表達，保護了線粒體的生物合成，在一定程度上改善了大鼠腎損傷。

當細胞狀態(tài)、代謝需求變化時，細胞中線粒體形態(tài)、定位也會隨著改變。對于哺乳動物來說，即使線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定的時候，細胞中的線粒體也在不停地進行著融合和分裂[26-29]。線粒體分裂蛋白有FIS1、DRP1、FIS1主要分布在線粒體外膜上，它通過募集DRP1開啟線粒體分裂過程，然而過表達DRP1可導致線粒體的片段化[30]。線粒體融合蛋白MFN1、MFN2是一種高度保守的定位于線粒體外膜上的GTP酶[31]。正常細胞線粒體分裂和融合處于動態(tài)平衡，過度分裂或者融合受阻可引起線粒體片段化，線粒體的片段化可導致急性腎損傷。研究發(fā)現(xiàn)，3-MCPD組線粒體分裂蛋白FIS1、DRP1的基因和蛋白水平均顯著上調(diào)，線粒體融合蛋白MFN1、MFN2的表達顯著下調(diào)，但是芹菜素協(xié)同處理組，無論在蛋白水平上還是基因水平上，線粒體分裂蛋白表達顯著下調(diào)，融合蛋白的表達呈劑量依賴性顯著上調(diào)。芹菜素在一定程度上保護了3-MCPD導致的線粒體融合分裂異常，避免了線粒體的片段化，有效降低了3-MCPD的腎毒性。

綜上，芹菜素通過緩解3-MCPD誘導的線粒體合成下降、線粒體過度分裂和融合受阻，顯著改善了3-MCPD導致的SD大鼠食欲不振、精神萎靡、腎組織病變等狀況，在一定程度上保護了3-MCPD誘導的腎損傷。