葡萄籽提取物原花青素誘導人食管癌細胞ECA109凋亡

郭方明，李述剛*，宋關玲，丁玉松，馮剛玲，牛 強，徐上知，胡云華

（石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000）

葡萄籽是葡萄汁、葡萄酒生產加工工藝中形成的主要的副產品。作為原花青素的有效來源之一，葡萄籽中富含原花青素二聚體、三聚體以及低聚合度的表兒茶酸[1]。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins extract，GSPE）是有效的自由基清除劑，在人體、動物或細胞中都具有較強的抗氧化能力[2-4]；另外研究也發現葡萄籽原花青素可以拮抗砷所致肺組織的炎性改變[5]，近年來原花青素抗食管癌（esophageal carcinoma，EC）的作用也屢有報道[6-8]，但其機制尚不明確。

細胞凋亡的抑制被認為是癌癥發生發展的重要原因[9]，許多化學預防藥物已被證明是通過誘導細胞凋亡從而起到抗癌的作用；而細胞凋亡主要通過Bax活性改變引起的線粒體凋亡途徑調控，有大量的文獻研究證實在不同癌組織中均有Bax的低表達和Bcl-2的高表達發生[10-13]。Caspase-3作為Bax/Bcl-2的下游信號通路，其激活與細胞凋亡密不可分。在多項關于抗癌作用的研究中都發現通過Caspase-3的活化誘導癌細胞凋亡是化學預防藥物抗癌的主要機制之一[14-16]。然而，Bax/Bcl-2和Caspase-3在GSPE誘導食管癌細胞中的作用鮮有報道。因此本研究通過GSPE干預人食管癌細胞ECA109 24 h，探討GSPE誘導ECA109細胞凋亡的潛在機制，以期為食管癌的膳食療法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ECA109細胞由新疆石河子大學新疆地方病與民族高發病重點實驗室提供，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液混勻，在透氣型細胞培養瓶中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養。細胞貼壁后24 h換液一次，細胞長滿培養瓶80%以上時傳代。取對數生長期細胞用于實驗。

葡萄籽原花青素（原花青素質量分數＞95%） 天津尖峰生物公司；核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）抑制劑BAY11-7082（BAY）、兔多抗IKK抗體、兔多抗NF-κB（p65）抗體、兔多抗Caspase-3抗體 英國Abcam公司；鼠單抗NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）抗體、鼠單抗p-IκB抗體、兔單抗NF-κB抗體（p50） 美國Cell Signaling公司；DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液 美國Hyclone公司。

1.2 儀器與設備

流式細胞儀 美國Thermo Fisher公司；680型酶標儀美國Bio-Rad公司；B1650001型電泳儀 迪申生物技術（上海）有限公司；ETC 811型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 北京愛尚陽光科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 噻唑藍法檢測GSPE對ECA109的抑制率

將生長狀態良好的ECA109細胞用胰蛋白酶消化，用含體積分數10%胎牛血清的DMEM制成細胞懸液。稀釋細胞濃度至2h104個/mL，按每孔100 μL接種于96 孔板（每孔約2h103個），培養24 h待細胞貼壁后棄去培養液，磷酸鹽緩沖液洗板后每孔加DMEM，并分別加入GSPE（0、25、50、100、200、400 μg/mL）和NF-κB信號通路特異性抑制劑BAY11-7082（0、2.5、5、10、15、20 μmol/L），空白對照組加入等體積DMEM，培養24 h后各孔加50 μL噻唑藍，37 ℃繼續培養8 h，棄去孔內液體，每孔加200 μL二甲基亞砜，37 ℃孵育，搖勻，待結晶充分溶解后于490 nm波長處測定OD值。細胞抑制率按如下公式計算。

1.3.2 流式細胞技術檢測ECA109細胞的凋亡

GSPE（0、25、50、80 μg/mL）＋BAY干預24 h的ECA109細胞培養至對數生長期，胰酶消化后用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，使用無血清培養基懸浮細胞并計數，調整細胞濃度為2h106個/mL，收集細胞，用Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit試劑盒說明書所給的步驟進行處理，每組重復3 次，最后用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.3.3 酶聯免疫吸附檢測炎性因子及細胞凋亡相關因子

對各組ECA109細胞的C型反應蛋白（C reactive protein，CRP）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及Bax/Bcl-2的在細胞培養上清液中的分泌水平按照相應的酶聯免疫吸附檢測試劑盒說明書所給的步驟進行檢測，每組重復3 次。

1.3.4 qPCR檢測NF-κB相關因子細胞內mRNA水平和Caspase-3 mRNA水平

實時熒光定量PCR（real-time PCR，qPCR）的引物設計如表1所示，其余步驟參考Zhao Boxin等[17]的方法。

表1 qPCR檢測NF-κB相關因子和Caspase-3 mRNA所用引物Table1 Primer sequences used for PCR ampli fi cation ofcaspase-3 and NF-κB related factors

1.3.5 Western blot檢測細胞內NF-κB相關因子和Caspase-3蛋白表達水平

ECA109細胞無血清DMEM配制的0、25、50、80 μg/mL GSPE＋BAY溶液處理24 h，用磷酸鹽緩沖液冰浴洗細胞兩次，加入混合蛋白酶抑制劑細胞提取液，12 000 r/min離心10 min。在質量分數12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離細胞抽提物，將所取得的蛋白轉移到硝酸纖維素膜。脫脂牛奶室溫封閉過夜并添加下列抗體：IKK、IκB、p-IκB、p50、p65、Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。最后充分洗膜，二抗孵育1 h后再次洗膜，最后顯影。每組重復3 次。

1.4 數據統計分析

實驗數據以平均值±標準差表示，用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。對于多組的均數比較用方差分析；最小顯著性差異法分析各組間差異。檢驗水準α＝0.05。

2 結果與分析

2.1 GSPE抑制ECA109細胞的增殖

BAY和GSPE均可抑制ECA109細胞的增殖。相比于空白對照組，隨著BAY濃度的升高，BAY對ECA109細胞的增殖率抑制效果顯著（圖1A）。同樣的，分別用0、25、50、100、200、400 μg/mL GSPE干預ECA109細胞24 h后，GSPE對ECA109細胞增值率的改變趨勢和BAY相似（圖1B）。進一步計算得到BAY對EAC109細胞干預24 h的半數抑制濃度（9.71 μmol/L）；GSPE對ECA109細胞干預24 h的半數抑制濃度（51.73 μg/mL）。因此，后續實驗中選擇BAY干預劑量為10 μmol/L；GSPE干預劑量分別為25、50、80 μg/mL。

圖 1 BAY（A）和GSPE（B）對ECA109細胞增殖的影響Fig.1 Effects of BAY (A) and GSPE (B) on cell proliferation in ECA109 cells

2.2 GSPE誘導ECA109細胞凋亡

圖 2 GSPE和BAY誘導ECA109細胞凋亡Fig.2 GSPE and BAY induce cell apoptosis in ECA109 cells

用流式細胞技術檢測BAY和GSPE對ECA109細胞凋亡的影響，發現GSPE單獨干預24 h，相比于空白對照組，ECA109細胞凋亡率上升到54.44%，而當25、50、80 μg/mL GSPE與BAY同時干預24 h后，ECA109細胞的凋亡率分別為43.42%、74.60%、82.80%，各組差異均顯著（P＜0.05）。本實驗采用了FITC和PI混合雙染。在流式細胞結果圖中，Q2象限代表晚期凋亡，而Q4象限代表早期凋亡。BAY＋GSPE干預24 h，ECA109細胞早期凋亡量和晚期凋亡量均升高（P＜0.05），并呈現劑量依賴關系（圖2F）。

2.3 GSPE抑制了ECA109細胞中炎性因子分泌

由圖3可知，空白對照組中，ECA109細胞中PGE2、CRP的分泌處于較高的水平，而施加GSPE對細胞中PGE2、CRP的分泌有抑制作用（P＜0.05）。此外，觀察了不同劑量GSPE和BAY同時作用24 h后PGE2和CRP的分泌情況，相比于50 μg/mL GSPE組，50 μg/mL GSPE＋BAY對PGE2和CRP的抑制作用更強，且隨著GSPE質量濃度的增加，PGE2和CRP的分泌量顯著降低（P＜0.05）。

圖3 BAY和GSPE對ECA109細胞中PGE2（A）和CRP（B）分泌的影響Fig.3 Inhibitory effect of BAY and GSPE on secretion of PGE2 and CRP (B) in ECA109 cells

2.4 GSPE對ECA109細胞中Bax和Bcl-2的表達水平影響

由圖4可知，在未施加任何干預處理的ECA109細胞中，Bax表達水平較低而Bcl-2高表達。50 μg/mL GSPE干預24 h可以促進Bax的表達而抑制Bcl-2（P＜0.05）；進一步觀察了不同劑量GSPE和BAY同時作用24 h后Bax和Bcl-2的分泌情況。相比于50 μg/mL GSPE組，50 μg/mL GSPE＋BAY對Bax的促進表達作用更強，且GSPE質量濃度越高，Bax的表達量越高（圖4A），Bcl-2的表達量越被抑制（圖4B）。

圖4 BAY和GSPE對ECA109細胞中Bax（A）和Bcl-2（B）蛋白表達的影響Fig.4 Effects of BAY and GSPE on the protein expression of Bax (A)and Bcl-2 (B) in ECA109 cells

2.5 GSPE對ECA109細胞中Caspase-3及NF-κB相關因子mRNA表達的影響

表2 BAY和GSPE對Caspase-3和NF-κB信號通路mRNA表達的影響（n＝3）Table2 Effects of BAY and GSPE on the mRNA expression of Caspase-3and NF-κB signaling (n= 3)

在正常的ECA109細胞中Caspase-3 mRNA的表達量低，NF-κB通路上IKK、IκB、p65、p50 mRNA的表達量高。當單純施加BAY干預24 h后，Caspase-3的mRNA表達水平上升，p65、p50和IKK的mRNA表達水平下降，而IκB的mRNA表達水平并沒有改變。而在BAY和GSPE同時干預組中，GSPE增強了BAY對Caspase-3、p65、p50 mRNA表達的作用，并使得IKK、IκB的mRNA表達下降。且隨GSPE質量濃度的增加，效果越明顯（表2）。

2.6 GSPE對ECA109細胞中Caspase-3及NF-κB相關因子蛋白表達的影響

用Western blot分別檢測了BAY單獨干預和BAY＋GSPE同時干預24 h后ECA109細胞中Caspase-3和NF-κB信號通路上IKK、IκB蛋白表達的改變，發現了與Caspase-3及NF-κB相關因子mRNA表達相似的改變（圖5、表3）。

表 3 BAY和GSPE對Caspase-3和NF-κB信號通路蛋白表達的影響（n＝3）Table3 Effects of BAY and GSPE on protein expression of Caspase-3 and NF-κB signaling (n= 3)

圖 5 BAY和GSPE干預對Caspase-3、IKK、IκB、p-IκB、p65、p50蛋白表達的影響Fig.5 Effects of GSPE and BAY11-7082 on protein expression of Caspase-3 and NF-κB related factors in ECA109 cells

3 討 論

多種植物或膳食補充劑已被證明具有抗癌作用[18-20]。GSPE是這類膳食植物補充劑之一，已被證明具有抗炎[21]、抗腫瘤[22]活性。本次研究測定了不同質量濃度GSPE和BAY作用于ECA109細胞24 h后ECA109細胞的活性，發現GSPE和BAY可以抑制ECA109的增殖和侵襲能力，誘導ECA109細胞凋亡。這些改變都伴隨著PGE2、CRP水平降低，Bax和Caspase-3活性增強以及NF-κB信號通路的抑制。

誘導細胞凋亡可能是GSPE抗癌的機制之一。有多個途徑介導細胞凋亡[23-24]，其中包括Bax蛋白。Bax是Bcl-2蛋白家族成員之一，Bcl-2蛋白家族包括了具有抗凋亡活性的Bcl-2和促凋亡的Bax。正常狀態下，Bax與Bcl-2結合，以平衡狀態存在于細胞線粒體內，而Bax的激活可使線粒體膜通透性升高，釋放出凋亡因子進而使細胞凋亡。BAY和GSPE使細胞中Bax蛋白濃度升高，Bcl-2蛋白濃度下降，這就意味著BAY和GSPE活化了Bax，同時抑制了Bcl-2，使得Bax/Bcl-2的平衡被打破，促進了細胞的凋亡。有證據表明，癌細胞中炎性因子PGE2、CRP水平升高可抑制Bax活性而增強Bcl-2活性，使得細胞無限增殖[25]。同時，GSPE和BAY對PGE2、CRP有明顯的抑制作用。為了進一步證明BAY和GSPE介導Bax活性增加，Bcl-2活性減弱，進而引起了ECA109細胞凋亡，本實驗檢測了Caspase-3的mRNA和Caspase-3蛋白表達的變化。Caspase-3是細胞凋亡的關鍵因子之一，當Bax/Bcl-2平衡打破，使線粒體膜電位降低，從而凋亡因子被釋放到細胞質中，與Caspase結合區結合從而激活Caspase-3引起細胞凋亡。BAY和GSPE促進了Caspase-3的mRNA和Caspase-3蛋白表達，并且BAY和GSPE對Caspase-3的激活有協同作用，這就意味著GSPE和BAY通過活化Bax，抑制Bcl-2的活性，促進了Caspase-3的激活從而誘導了食管癌細胞的凋亡。

NF-κB信號通路參與了多種惡性腫瘤的發生和發展[26]。NF-κB主要是通過影響其下游的多種炎性因子和效應分子Bax/Bcl-2的表達而發揮抗凋亡作用。本研究發現，GSPE和BAY抑制了ECA109細胞中p-IκB的蛋白表達，這意味著GSPE對NF-κB活性的抑制可能是通過抑制IκB的磷酸化實現的。BAY是NF-κB信號通路的特異性抑制劑，同時也被證明為一種有效的癌細胞凋亡誘導劑。通過對比單純的GSPE干預組，發現GSPE和BAY11-7082同時作用更能夠抑制IκB的磷酸化水平。為了證明GSPE通過抑制NF-κB信號通路活性誘導ECA109細胞的凋亡，在單獨施加GSPE的基礎上設計了BAY與GSPE同時作用的實驗，發現GSPE和BAY聯合效果好于GSPE單獨實驗，具有協同作用。這提示了GSPE對NF-κB的抑制是通過抑制IκB的磷酸化實現的，具有與BAY相近的作用，且GSPE和BAY同時作用于ECA109時對NF-κB可能有協同抑制作用。另外，GSPE抑制了細胞中NF-κB p50/p65的mRNA和p50/p65蛋白表達。NF-κB p50/p65是NF-κB信號通路中最常見的異源二聚體，也是NF-κB發揮活性功能的重要蛋白。GSPE抑制NF-κB p50/p65可能由于GSPE抑制了IκB的磷酸化實現的，這與Mackenzie等的研究結果一致[27]。而另外一些研究認為，原花青素對于NF-κB p50/p65表達的抑制可能是由于原花青素的異二聚體可以通過模仿NF-κB p50/p65序列上的精氨酸殘基建立氫鍵從而抑制了p50/p65的表達[28-29]。而本研究尚不能說明GSPE的化學構像是否與NF-κB p50/p65的表達有聯系。

綜上可知，GSPE對ECA109細胞具有促進凋亡的作用。GSPE通過抑制NF-κB，調控PGE2、CRP的表達，進而活化Bax蛋白，抑制Bcl-2，從而使Caspase-3激活，誘導了細胞凋亡。

本研究闡釋了GSPE抗癌的可能的分子機制，但是癌癥的發生發展以及癌細胞的遷移和侵襲是多因素多途徑的復雜的過程，因此其具體的機制仍需要大量的研究，為進一步探討原花青素的抗癌作用和原花青素的有效利用提供依據。