植物乳桿菌WW對高脂血癥大鼠體脂的影響

郭晶晶，烏日娜，安飛宇，李 洋，祝新媛，武俊瑞*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

心血管疾病是導致人類死亡的主要原因之一，其造成的死亡人數占全球總死亡人數的29%左右[1-2]。膽固醇對幾種生理功能至關重要，對某些激素和維生素的形成是必要的，是細胞膜和神經細胞的重要組成部分[3]。然而，血清膽固醇水平升高被廣泛認為是動脈粥樣硬化、冠心病和中風等心血管疾病的危險因素[4-6]。流行病學和臨床研究表明：在膽固醇含量與心血管疾病之間存在著顯著的正相關，血清膽固醇下降1%可將心血管疾病風險下降3%[7-9]。雖然膽固醇是人體組織細胞所不可缺少的重要物質，但攝入的食物也會影響血漿脂質水平，疾病管理的主要預防措施之一是通過飲食和藥物治療來控制血液膽固醇和甘油三酯水平，最顯著的是通過使用他汀類藥物[10-11]。其他預防措施包括低膽固醇低脂肪食物的攝入、高膳食纖維食物的攝入，或者含有益生菌食物的攝入，例如雙歧桿菌、植物乳桿菌等[12-14]。國內外越來越多的研究表明補充益生菌可以改善脂質代謝，降低血清膽固醇含量[15-17]。

植物乳桿菌是公認的一種益生菌，存在于許多食品中，同時也存在于人體胃腸道中，對人體健康具有良好的促進作用[18]。植物乳桿菌具有很多生理功能，如增強機體免疫力、促進營養物質吸收、維持腸道內菌群平衡等，許多研究表明植物乳桿菌也具有降低血清膽固醇的作用[19-20]。Nguyen等[21]通過動物實驗證實從嬰兒腸道中分離出的植物乳桿菌PH04具有降膽固醇的功能。胡夢坤等[22]從泡菜中篩選出一株高效降膽固醇的植物乳桿菌LP1103，通過動物實驗表明其在體內也有高效的降膽固醇作用。張健等[23]通過研究證實了植物乳桿菌L01對喂食高脂膳食的大鼠脂質代謝中的降膽固醇功效。Li Chuan等[24]也通過大鼠模型實驗證明了植物乳桿菌NCU116的降膽固醇作用。

許多學者研究了來自發酵乳制品和泡菜等制品中的乳酸菌的降膽固醇特征，然而很少有關于傳統發酵豆醬中乳酸菌的降膽固醇作用的研究，因此，本研究旨在評估從東北傳統發酵豆醬中篩選出的植物乳桿菌WW在喂食高膽固醇飲食的大鼠中的益生特征和降膽固醇潛力。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

植物乳桿菌WW（L. plantarum WW），分離自東北自然發酵豆醬。

32 只5 周齡清潔級雄性SD大鼠，體質量約為120～135 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001。

高脂飼料（基礎飼料87.7%（質量分數，下同）、膽固醇2%、豬油10%、膽酸鈉0.3%）購自遼寧長生生物技術股份有限公司。

MRS液體培養基為本實驗室自制；15%脫脂乳培養基 內蒙古金德瑞貿易有限責任公司。

總膽固醇（totalcholesterol，TC）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein-cholesterol，HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein-cholesterol，LDL-C）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

二甲苯、無水乙醇、濃鹽酸、硫酸鋁、碘酸鈉、檸檬酸 國藥集團化學試劑有限公司；蘇木精 北京索萊寶科技有限公司；曙紅Y（醇溶） 生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；UV-4802紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；生物潔凈工作臺 蘇州市華宇凈化設備有限公司；5418R小型臺式冷凍離心機德國Eppendorf公司；DNP-9080型生化培養箱、QH01-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏試驗儀器有限公司；冷藏冷凍箱 青島海爾股份有限公司；ELX-800酶標儀 美國BioTek公司；DH36001B電熱恒溫培養箱 天津泰斯特公司；H-2050R超速冷凍離心機湖南湘儀公司；RM2235石蠟切片機 德國Leica公司；DP73顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化與菌懸液的制備

將L. plantarum WW活化3 代，以2%接種量接種于MRS培養基中，37 ℃培養12 h，將培養液6 000 r/min離心3 min，用無菌生理鹽水洗滌2 次，收集菌體，用15%的無菌脫脂乳復溶成菌懸液，菌落計數，調整菌液濃度至1h1010CFU/mL，用于大鼠灌胃。

1.3.2 動物分組及飼養

3 2 只S D大鼠1 2 h亮暗循環飼養，室內溫度20～22 ℃，相對濕度60～65%，保持動物房通風、透光和清潔衛生。實驗前大鼠自由攝食飲水，適應性飼養一周后，將大鼠按照各組之間平均體質量無顯著差異分為4 組：正常對照組飼喂基礎飼料＋無菌水、高脂模型組飼喂高脂飼料＋無菌水、脫脂乳對照組飼喂高脂飼料＋無菌脫脂乳、菌液干預組飼喂高脂飼料＋菌懸液（1h1010CFU/mL），每組8 只。每只大鼠灌胃量為10 mL/kg mb，每天上午定時灌胃，連續灌胃12 周。

1.3.3 動物樣品采集

每天記錄各組大鼠的攝食量，每周記錄體質量。收集各組大鼠最后3 d的糞便，－80 ℃保存，用于糞便指標的檢測。12 周飼養結束后，稱量體質量，禁食過夜，靜脈取血，用于血清血脂的檢測。解剖取肝臟、脾臟、腎臟和心臟，用冷的生理鹽水沖洗干凈后濾紙吸干水分，分別稱質量，按式（1）計算臟器指數。

摘取腹部脂肪、腎周脂肪及附睪脂肪，分別稱質量并按式（2）計算脂肪系數。

從大鼠肝臟最大肝葉中（同一部位）切取相同大小的組織塊，放入質量分數10%甲醛溶液中固定24 h，進行HE組織染色。其余肝臟用液氮迅速冷凍，－80 ℃冰箱保存，并盡快進行后續實驗。

1.3.4 樣品指標測定

1.3.4.1 血清指標測定

將取得的血液樣品于3 000 r/min離心15 min，小心吸取上層血清，按照試劑盒說明書要求測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、TBA、MDA、ALT、AST水平。

1.3.4.2 肝臟指標測定

準確稱取肝臟質量，按1∶9（m/V）的比例加入9 倍的生理鹽水，冰浴條件下機械勻漿，2 500 r/min離心10 min，制備成質量分數10%的勻漿上清液。按照試劑盒說明書要求測定肝臟中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT和AST水平。

1.3.4.3 肝臟組織HE染色

將肝臟組織進行脫水、石蠟包埋，切成厚5 μm的薄片，放在60 ℃溫箱中2 h，烘干。將切片脫蠟至水后用蘇木精和伊紅染液進行染色，然后脫水、透明、封片，最后于顯微鏡下觀察染色效果，于200 倍鏡下拍照。

1.3.4.4 糞便指標測定

準確稱取糞便質量，按1∶9（m/V）的比例加入生理鹽水，冰浴條件下機械勻漿，2 500 r/min離心10 min，制備成質量分數10%的勻漿上清液。按照試劑盒說明書要求測定糞便中TC、TG和TBA水平。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 17.0統計軟件對各實驗數據進行方差分析和顯著性檢驗。P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 L. plantarum WW對大鼠體質量和攝食量的影響

在大鼠12 周飼養期間未出現異常體征，實驗結束后大鼠體質量增加量、總攝食量的記錄結果如表1所示。

表1 各組大鼠的體質量增加量、總攝食量（n＝8）Table1 Body mass gain and total food intake of rats in each group (n= 8)

在4 組大鼠12 周的飼養過程中，每組大鼠體征正常，沒有死亡現象。由表1可知，4 組大鼠初始體質量沒有顯著差異，在12 周飼養結束后，相對于正常對照組，高脂模型組大鼠的最終體質量顯著增加（P＜0.05），體質量增加量也顯著升高（P＜0.05），總攝食量顯著增加（P＜0.05），這說明高脂飲食能夠引起大鼠體質量的增加，初步確定高脂模型構建成功；相對于高脂模型組和脫脂乳對照組，菌液干預組的大鼠總攝食量顯著降低（P＜0.0 5），同時體質量增加量也有所降低（P＞0.05），這說明L. plantarum WW能夠通過減少大鼠的攝食量來抑制體質量的增加。

2.2 L. plantarum WW對大鼠臟器指數和脂肪系數的影響

表2 各組大鼠的臟器指數、脂肪系數（n＝8）Table2 Indexes of organ and fat of rats in each group (n= 8)

從表2中臟器指數可以看出，4 組大鼠的心臟指數、腎臟指數和脾臟指數差異不顯著（P＞0.05），這說明L. plantarum WW對大鼠的心臟、腎臟和脾臟無毒副作用。從肝臟指數情況來看，高脂模型組和脫脂乳對照組肝臟指數顯著高于正常對照組和菌液干預組（P＜0.05），而且菌液干預組的肝臟指數略低于正常對照組，但差異不顯著（P＞0.05），這說明高脂飲食引起了脂肪在肝臟的堆積，而L. plantarum WW能夠有效地降低脂肪在肝臟的堆積，進而緩解肝臟的損傷。從脂肪系數來看，相對于正常對照組，高脂模型組和脫脂乳對照組大鼠的腹部脂肪系數、腎周脂肪系數和附睪脂肪系數顯著升高（P＜0.05），而灌胃L. plantarum WW菌懸液后，腹部脂肪系數、腎周脂肪系數和附睪脂肪系數均顯著降低（P＜0.05），說明L. plantarum WW能夠有效降低高脂大鼠體內的脂肪量。

2.3 L. plantarum WW對大鼠肝臟組織病理形態學的影響

通過對各組大鼠肝臟組織進行HE染色來進一步確定L. plantarum WW對高脂飲食引起的肝臟脂肪堆積的改善作用。

圖1 L. plantarum WW對大鼠肝臟組織病理形態學的影響（×200）Fig.1 Effect of L. plantarum WW on pathological morphology of liver tissue (× 200)

由圖1可見，根據組織切片觀察，正常飲食大鼠肝細胞呈索狀排列，細胞質呈紅色，細胞核位于細胞中央。然而，在高脂模型組和脫脂乳對照組大鼠的肝臟中觀察到胞漿中有明顯的空泡形成和增加的脂質沉積，其特征為圓形細胞，邊緣核和脂肪空泡化。灌胃L. plantarum WW后減輕了大鼠肝組織中的脂質沉積和空泡化的程度，與正常飲食的大鼠肝臟類似，但未恢復到正常水平。因此進一步說明L. plantarum WW能夠有效減少脂肪在肝臟的堆積，緩解高脂飲食引起的肝臟損傷。

2.4 L. plantarum WW對大鼠血清血脂水平的影響

表3 L. plantarum WW對大鼠血清血脂水平的影響（n＝8）Table3 Effect of L. plantarum WW on serum lipid levels in rats (n= 8)

從表3中可以看出，高脂飲食大鼠血清中的TC、TG、LDL-C濃度顯著高于正常對照組（P＜0.05），說明高脂模型造模成功。與高脂模型組和脫脂乳對照組相比，菌液干預組血清中TC、TG、LDL-C的濃度顯著降低（P＜0.05），相對于高脂模型組分別降低了28.92%、22.47%和28.99%，相對于脫脂乳對照組分別降低了26.73%、21.29%和26.87%，這說明L. plantarum WW能夠有效降低高脂飲食大鼠的血清血脂水平。HDL-C主要功能是轉運磷脂和膽固醇，是一種抗動脈粥樣硬化的脂蛋白，能促進外周組織中膽固醇的消除，防止冠心病的發生[25]。從表3可以看出，菌液干預組血清中HDL-C的濃度顯著高于高脂模型組和脫脂乳對照組（P＜0.05），說明L. plantarum WW能夠幫助降低患動脈粥樣硬化等心血管疾病的風險。

2.5 L. plantarum WW對大鼠血清MDA和TBA濃度的影響

圖2 L. plantarum WW對大鼠血清MDA（A）和TBA（B）濃度的影響Fig.2 Effect of L. plantarum WW on MDA (A) and TBA (B) contents in serum

MDA是不飽和脂肪酸過氧化反應的終產物，血清MDA水平被認為是由膽固醇引起的氧化應激的表達，通過測定血清中MDA濃度來判斷脂質過氧化的程度和氧自由基的含量，氧自由基含量高會增加心血管疾病的發生幾率[26-27]。從圖2A可以看出，與正常對照組相比，高脂模型組和脫脂乳對照組血清中MDA的濃度顯著升高（P＜0.05），灌胃L. plantarum WW后血清中MDA濃度顯著降低（P＜0.05），相對于高脂模型組和脫脂乳對照組分別降低了32.21%和37.83%，說明L. plantarum WW可以通過降低MDA濃度來緩解脂質過氧化程度。

TBA是膽固醇在肝臟分解代謝的最終產物，與膽固醇的吸收、代謝及調節有著密切的關系，血清TBA水平變化可敏感地反映肝臟功能[28]。從圖2B可以看出，與正常對照組相比，高脂模型組和脫脂乳對照組血清中TBA的濃度顯著升高（P＜0.05），灌胃L. plantarum WW后血清中TBA濃度顯著降低（P＜0.05），相對于高脂模型組和脫脂乳對照組分別降低了22.67%和21.72%，接近于正常水平。說明L. plantarum WW能夠有效降低高脂飲食引起的血清TBA濃度升高，從而減少肝臟實質性損傷。

2.6 L. plantarum WW對大鼠肝臟血脂各指標水平的影響

由表4可知，與正常對照組相比，高脂模型組和脫脂乳對照組肝臟TC、TG、LDL-C含量顯著升高（P＜0.05），而在灌胃L. plantarum WW后，肝臟TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），相對于高脂模型組分別降低了31.32%、26.09%和16.36%，相對于脫脂乳對照組分別降低了23.31%、28.42%和20.69%，其中TC水平接近于正常值。從HDL-C水平來看，菌液干預組、高脂模型組和脫脂乳對照組顯著低于正常對照組（P＜0.05），菌液干預組大鼠肝臟HDL-C含量高于高脂模型組和脫脂乳對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。以上結果表明L. plantarum WW能夠有效降低高脂飲食引起肝臟中血脂水平的升高，進而對肝臟起到一定的保護作用。

表4 L. plantarum WW對大鼠肝臟血脂水平的影響（n＝8）Table4 Effect of L. plantarum WW on lipid levels in liver of rats (n= 8)

2.7 L. plantarum WW對大鼠血清和肝臟ALT和AST活力的影響

圖3 L. plantarum WW對血清和肝臟ALT和AST活力的影響Fig.3 Effect of L. plantarum WW on ALT and AST activity in serum and liver

轉氨酶是催化氨基酸和酮酸之間氨基轉移的一類酶，其中ALT和AST是評價肝功能的重要指標，當肝臟組織受到損傷時，由于細胞膜通透性增加，肝細胞漿內的ALT和AST釋放到血液中，導致肝臟和血清中兩者水平有所升高[29-30]。從圖3中可以看出，高脂模型組與脫脂乳對照組血清和肝臟中ALT和AST活力顯著高于正常對照組（P＜0.05），菌液干預組血清和肝臟中ALT和AST活力顯著低于高脂模型組和脫脂乳對照組（P＜0.05），相對于高脂模型組，血清中ALT和AST活力分別降低了28.65%和29.32%，肝臟中ALT和AST活力分別降低了26.62%和22.89%。結果表明L. plantarum WW能夠通過有效降低高脂飲食引起的血清和肝臟中ALT和AST活力的升高來緩解肝損傷。

2.8 L. plantarum WW對大鼠糞便TC、TG和TBA含量的影響

表5 L. plantarum WW對大鼠糞便中TC、TG和TBA含量的影響（n＝8）Table5 Effect of L. plantarum WW on TC, TG and TBA levels in feces of rats (n= 8)

由表5可知，與正常對照組相比，高脂模型組和脫脂乳對照組糞便中TC、TG含量顯著升高（P＜0.05），這說明高脂飲食中含量過高的膽固醇無法在體內被消化吸收，隨糞便排出了體外。菌液干預組糞便中TC、TG含量相對高脂模型組和脫脂乳對照組顯著升高（P＜0.05），分別比高脂模型組高17.02%和21.53%，說明L. plantarum WW能夠促進大鼠體內膽固醇隨糞便的排出。

TBA與膽固醇的吸收、代謝和調節有著密切的關系，促進膽汁酸在腸道的排泄是降低體內膽固醇代謝的主要途徑[31]。從表5中可以看出，高脂飲食大鼠糞便中TBA含量顯著高于正常對照組大鼠（P＜0.05），灌胃L. plantarum WW后糞便中TBA含量顯著升高，與高脂模型組相比升高了27.00%，說明L. plantarum WW能有效促進大鼠體內TBA的排泄，從而降低血清中膽固醇的含量，減少心血管疾病的發生。

3 討 論

高脂血癥通常表現為血清TC、TG和LDL-C水平的升高，伴隨著HDL-C水平降低，與心血管疾病密切相關[32]。眾所周知，高脂飲食可增加血液中的TC、TG和LDL-C水平，導致動脈粥樣硬化發展的風險增加，而高水平的HDL-C可降低心血管疾病的風險。此外，LDL-C被認為是血清脂質中最危險的因素，這是由于氧化型LDL-C向動脈壁滲透的增加導致了動脈粥樣硬化斑塊病變[33-34]。本研究通過飼喂高脂飲食來建立大鼠高脂模型，5 周齡SD大鼠飼喂高脂飼料12 周后，血清中TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C含量顯著降低（P＜0.05），表明高脂模型建立成功。L. plantarum WW灌胃12 周后顯著降低了血清中TC、TG、LDL-C濃度（P＜0.05），并且提高了HDL-C濃度（P＜0.05），與高脂模型組相比血清TC、TG、LDL-C濃度分別降低了28.92%、22.47%和28.99%。丁盼盼等[35]研究發現高脂小鼠灌胃L. plantarum L-3 30 d后血清中TC、TG含量分別降低了31.3%和20.44%；在Bao Yan等[34]的研究中，以大鼠為模型，將L. plantarum P-8實驗菌株灌胃大鼠4 周后發現，相對于高脂模型組，菌液組大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量分別降低了53.83%、47.68%和39.91%；而在Nguyen等[21]的研究中發現給小鼠模型灌胃L. plantarum PH04 14 d后，小鼠血清中TC、TG水平分別只降低了7%和10%。本研究與已報道研究結果相似但存在一定差異，主要可能與菌株類型、飼養時間、實驗動物、菌液灌胃量等相關。

炎癥標志物濃度升高、肝臟中脂肪的積累和血清脂質水平的升高，可能導致胰島素抵抗、血脂異常和心血管疾病，此外，肝臟中過量的脂肪堆積可能導致肝臟氧化應激和肝臟損傷[36]。從本研究中肝臟指數可以看出，菌液干預組顯著低于高脂模型組和脫脂乳對照組（P＜0.05）；從肝臟組織病理形態學分析來看，灌胃L. plantarum WW后減輕了其肝組織中的脂質沉積和空泡化的程度，這與Li Chuan等[24]的研究結果類似。從肝臟血脂水平來看，在灌胃L. plantarum WW后，肝臟TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05），相對于高脂模型組分別降低了31.32%、26.09%和16.36%，TC水平接近于正常值，該結果與Huang Ying等[37]的研究結果類似但也存在一定的差異。此外，菌液干預組血清和肝臟中ALT和AST的含量顯著低于高脂模型組和脫脂乳對照組（P＜0.05），相對于高脂模型組，血清中ALT和AST活力分別降低了28.65%和29.32%，肝臟中ALT和AST活力分別降低了26.62%和22.89%。以上結果表明L. plantarum WW能夠有效降低高脂飲食引起肝臟中血脂水平的升高，進而對肝臟起到一定的保護作用。

另一個值得注意的現象是灌胃L. plantarum WW后糞便中TC、TG和TBA含量顯著升高（P＜0.05），與高脂模型組相比分別升高了17.02%、21.53%、27.00%，說明L. plantarum WW能有效增加大鼠體內TC、TG、TBA的排泄，從而降低血清中膽固醇的含量，減少心血管疾病的發生。

4 結 論

L. Plantarum WW能夠抑制高脂飲食引起的體質量增加，降低脂肪在肝臟、腹部、腎周和附睪部位的堆積，顯著降低肝臟和血清血脂水平以及ALT和AST水平，增加HDL-C含量，并且能夠顯著降低血清中MDA和TBA水平，增加糞便中TC、TG和TBA含量。以上結果表明L. Plantarum WW能夠有效降低高脂飲食引起的體內血脂水平的升高以及脂肪在肝臟和體內的堆積，進一步有助于降低動脈粥樣硬化等心血管疾病的患病率，并且對肝臟有一定的保護作用，為進一步深入研究和開發降膽固醇產品提供了有益菌株和理論依據，但該菌株降膽固醇具體是一種機制作用還是多種機制共同作用，還需要進一步深入研究驗證。