海參腦苷脂對前脂肪細胞分化的抑制作用及機制

王美玲，劉亞軒，黎晨曼，劉媛媛，符 萌，王靜鳳*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

隨著人們生活質量的不斷提高，肥胖已經成為常見的代謝綜合征之一[1]，可引發心血管疾病、II型糖尿病等一系列慢性疾病[2]，已經變成全世界重要的社會問題。如今，肥胖人群的數量不斷上漲，肥胖及其代謝綜合征的發病率也在不斷升高[3-4]。越來越多的研究發現，脂肪組織中存在的一些炎癥可能和肥胖有關的機體代謝紊亂存在一定的關聯[2,5]。因此，對于可有效控制肥胖的活性物質研究對人類發展存在重要的意義。研究證實，肥胖與前脂肪細胞的增殖和分化密切相關[6]，前脂肪細胞中脂肪酸的過多積累以及脂肪細胞的肥大均可誘導肥胖的發生[7]。脂肪細胞的肥大以及增生會導致組織缺氧，從而誘發一些其他的組織炎癥[8]。在人的一生中，脂肪細胞數量增加主要發生在胚胎發生期和青春期早期，成人體內脂肪細胞數量維持恒定，但是脂肪細胞卻在逐漸增大[9]，Kwan等指出增加脂肪細胞的脂肪分解可能是一種治療肥胖的有效策略，其研究發現降低脂肪細胞中甘油三酯（triglyceride，TG）的含量會使小鼠體質量下降[10]。所以，調節前脂肪細胞的增殖以及分化有助于某些慢性疾病的改善。

腦苷脂是一種中性鞘糖脂，由神經酰胺和單糖組成；其中，神經酰胺是由長鏈脂肪酸中的羧基與長鏈堿的氨基經脫水以酰氨鍵相連形成的一類酰胺類化合物。人們于19世紀開始關注海洋生物中的腦苷脂，其作用溫和，適合慢性疾病的治療[11]，研究表明腦苷脂可以抗病毒、抗腫瘤，在免疫調節等方面扮演著重要的角色。海參具有很多的食療以及營養價值，同時體內存在很多具備多種活性的成分，其中就包含腦苷脂。腦苷脂的生物活性與其在體內代謝產生的神經酰胺及長鏈堿密切相關，而海參腦苷脂中存在獨特的、不飽和程度更高的長鏈堿。研究表明，海參腦苷脂具有神經保護作用，可以改善阿爾茨海默病；海參腦苷脂可以調節糖代謝和脂質代謝，從而改善機體的能量代謝[12]。本實驗采用3T3-L1小鼠脂肪細胞研究海參腦苷脂對其增殖、分化的阻抑作用及機理，以期為研究功能性海洋活性物質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海參購于青島水產市場；3T3-L1細胞株購自美國模式培養物研究所。

DMEM培養基 美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Hyclone公司；二甲基亞砜、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰蛋白酶、地塞米松、胰島素、油紅O染料 美國Sigma公司；TRIzol試劑美國Invitrogen公司；SRBP Green熒光染料 瑞士Roche公司；M-MLV逆轉錄酶 日本Takara公司；CCAAT/增強子結合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein alpha，C/EBPα）、過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、β-actin抗體 英國Abcam公司；丙烯酰胺、牛血清白蛋白、RIPA裂解液 北京索萊寶科技公司產品；脫脂牛奶美國BD公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

2711型CO2培養箱 德國Heraeus公司；倒置顯微鏡日本Olympus公司；Neofuge 13R型離心機 上海力申科學儀器公司；酶標儀、熒光實時定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司；PVDF膜 美國Milipore公司；脫色搖床北京六一生物科技有限公司；全自動凝膠成像分析儀上海培清科技公司。

1.3 方法

1.3.1 海參腦苷脂的制備

將海參磨碎后稱取2 kg粉末，用9 L氯仿-甲醇溶液（體積比2∶1）體系浸提12 h后過濾。重復浸提3 次，收集多次提取所得的浸提液，后旋轉蒸發至其干燥，得脂質粗提物。然后采用正相硅膠柱層析法分離所得脂質粗提物，用三氯甲烷-甲醇溶液（體積比95∶5）進行梯度洗脫并收集洗脫液，采用薄層層析法測定洗脫液的成分，并合并其中比移值相同的組分。將這些組分濃縮使其干燥，得到海參腦苷脂。經高效液相色譜法分析后，海參腦苷脂純度為99%。

1.3.2 3T3-L1細胞的培養和分化

3T3-L1細胞用含10% FBS（體積分數，下同）的DMEM完全培養液，在5% CO2、37 ℃培養箱中培養。細胞融合至90%左右時進行傳代。調整細胞的濃度并將其加入24 孔板中，使每孔細胞數為2h104個。待細胞長滿并且接觸抑制48 h后，換為含有FBS（10%）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（0.5 mmol/L）、地塞米松（1 μmol/L）、胰島素（10 μg/mL）的完全培養液中繼續培養。48 h后，換為含有胰島素（10 μg/mL）和FBS（10%）的高糖DMEM培養基。之后每2 d換為血清體積分數為10%的高糖DMEM完全培養液。

1.3.3 3T3-L1細胞增殖情況測定

調整細胞濃度并將其接種于96 孔板中，使每孔細胞數為2h103個。24 h后，更換含有不同質量濃度海參腦苷脂的完全培養液，每組設置3 個平行孔。根據前期與腦苷脂相關的細胞實驗以及預實驗結果，最終將質量濃度設為62.5、125、250 μg/mL，繼續培養相應時間后，加入噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT），孵育4 h，在570 nm波長處測定不同組細胞的吸光度。

1.3.4 3T3-L1細胞LDH活力測定

細胞接種及加樣方法同1.3.3節。不同質量濃度海參腦苷脂處理3T3-L1細胞4 d后，采用試劑盒測定乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活力。

1.3.5 3T3-L1細胞分化過程脂質蓄積情況測定

3T3-L1細胞誘導分化的方法同1.3.2節。分別于分化第0、2、4天加入含不同質量濃度海參腦苷脂（0、62.5、125、250 μg/mL）的培養液。細胞分化至第8天時，脂肪細胞用體積分數10%多聚甲醛固定20 min后，用體積分數0.5%油紅O染液染色30 min，用體積分數60%異丙醇清洗后拍照。每孔加入異丙醇溶解油紅O染液，調整酶標儀于490 nm波長處檢測吸光度。半定量檢測已分化細胞中含有脂質的含量。

1.3.6 反轉錄qPCR法檢測Wnt/β-catenin通路關鍵基因mRNA的表達

調整細胞濃度并將其加入24 孔板中，使每孔最終的細胞量為2h104個。按1.3.2節方法誘導3T3-L1細胞分化。在細胞分化第0、2、4、8天時，用RNA提取試劑盒收集細胞中總RNA。將所提總RNA逆轉錄為cDNA。將cDNA 5 倍體積稀釋后進行擴增，總體系為25 μL，其中SYBR 12.5 μL、稀釋后cDNA 5 μL、上下游引物各0.75 μL、雙蒸水6 μL。PCR條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸45 s，循環45 次。所用引物序列如表1所示。以β-actin為內參，所測基因的相對表達量以與β-actin表達量的比值表示。1.3.7 Western blotting法檢測β-catenin總蛋白以及核蛋白的表達

表1 PCR擴增關鍵基因的引物序列Table1 Primer sequences used for PCR amplif i cation of key factors

調整細胞濃度并將其加入24 孔板中，使每孔最終細胞數為2h104個。按1.3.2節方法誘導3T3-L1細胞分化，在細胞分化到第0、2天時加入250 μg/mL的海參腦苷脂，每組4 個平行孔。待細胞分化到第4天后，用D-Hanks液沖洗2～3 次，然后每組加入相應裂解液，于低溫條件下使細胞裂解5～10 min，然后離心取上清液。BCA試劑盒測定蛋白質量濃度，按需要補充4×上樣緩沖液，100 ℃水溫下孵育10 min，得到總蛋白。于分化第4天時收集細胞，按照試劑盒所述方法收集細胞核內蛋白。取上述所提樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將目的蛋白條帶進行轉膜，然后進行封閉。一抗孵育后，用含有標記的二抗孵育2 h。充分洗滌后和超敏發光液作用，暗室曝光后掃描。細胞總β-catenin和核β-catenin分別以β-actin和TATA結合蛋白（TATA-binding protein，TBP）為內參。

1.4 數據統計與分析

實驗結果以fs表示，應用SPSS軟件完成統計分析，并進行最小顯著性差異法兩兩比較，P＜0.05為具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 海參腦苷脂在3T3-L1細胞增殖過程中的作用

正常增殖細胞中的琥珀酸脫氫酶能與MTT結合產生不溶于水的結晶紫甲瓚，而失去增殖能力的細胞則無法和MTT相結合，因此根據這一原理可反映細胞的數目。同時，可根據MTT實驗來探究受試物對細胞是否具有毒性作用。

圖1 海參腦苷脂對3T3-L1細胞增殖的影響Fig.1 Effect of cerebroside on proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

由圖1可知，與對照組相比，各質量濃度海參腦苷脂處理過的3T3-L1細胞數目均有下降趨勢，而且具有時間劑量效應。其中250 μg/mL海參腦苷脂對前脂肪細胞生長的抑制率較高，作用96 h后，抑制率達到27.52%。

2.2 海參腦苷脂對3T3-L1細胞LDH分泌情況的影響

LDH廣泛分布于各種組織內。若細胞受到毒性作用，則會分泌釋放過多LDH。由圖1可知，各質量濃度的海參腦苷脂可以不同程度地抑制3T3-L1細胞的增殖，為進一步驗證海參腦苷脂是否存在毒性作用，收集了海參腦苷脂作用96 h后的細胞上清液。

圖2 海參腦苷脂對3T3-L1細胞培養上清液中LDH活力的影響Fig.2 Effects of sea cucumber cerebroside on LDH activity in culture supernatant of 3T3-L1 preadipocytes

由圖2可知，各質量濃度海參腦苷脂對培養上清液中LDH活力均無顯著影響，說明海參腦苷脂對3T3-L1細胞沒有毒性作用。

2.3 海參腦苷脂對3T3-L1細胞分化過程脂質蓄積的影響

圖3 海參腦苷脂對3T3-L1細胞分化過程的影響Fig.3 Effect of sea cucumber cerebroside on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

3T3-L1細胞進入分化后，細胞回縮變圓并開始出現脂滴，隨著時間的推移，細胞內的脂滴會慢慢增多。如圖3A所示，對照組脂肪細胞大部分具有脂滴，而且所含脂滴比較飽滿，而添加不同質量濃度海參腦苷脂的脂肪細胞脂滴相應減少，并且抑制作用具有劑量效應。油紅O染色實驗進一步表明，海參腦苷脂可以明顯阻抑3T3-L1細胞的分化，且抑制效果隨質量濃度升高而加強。其中，250 μg/mL海參腦苷脂的作用最明顯（圖3B）。同時，測定了海參腦苷脂處理后脂肪細胞中TG含量的變化。如圖3C所示，經不同質量濃度的海參腦苷脂處理后，TG含量極顯著下降（P＜0.01），且抑制效果隨質量濃度升高而加強。其中，250 μg/mL海參腦苷脂作用最明顯，相比于對照組，TG含量降低了30.67%。

2.4 海參腦苷脂對3T3-L1細胞C/EBPα和PPARγ mRNA表達的影響

PPARγ、C/EBPα是脂肪細胞在分化過程中的關鍵轉錄調控因子，在脂肪細胞分化過程中有十分重要的作用，能夠啟動脂肪細胞分化有關基因的轉錄表達[13]。PPARγ以及C/EBPα共同作用，使脂肪特異性基因表達啟動，從而促進長鏈脂肪酸的生成和累積[14]。

圖4 海參腦苷脂對3T3-L1細胞分化過程的影響Fig.4 Effect of sea cucumber cerebroside on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

由圖4可知，與對照組相比，海參腦苷脂可以極顯著降低脂肪細胞分化過程中第4、8天時C/EBPα和PPARγ的mRNA表達量（P＜0.01）。

2.5 海參腦苷脂對3T3-L1細胞Wnt/β-catenin通路基因mRNA表達的影響

Wnt/β-catenin通路在脂肪細胞的分化過程中扮演著非常重要的角色[15]。研究表明，FZ1作為Wnt/β-catenin通路中不可或缺的一員，是Wnt蛋白在細胞中的重要受體[16]。LRP5為LRP家族的一員，該家族在Wnt/β-catenin通路中作為輔助受體也占據著不可或缺的角色[17]。而β-catenin和脂肪細胞的分化密切相關，當其表達量升高時可以降低脂肪細胞的分化水平。

圖5 海參腦苷脂對3T3-L1細胞Wnt/β-catenin通路基因mRNA表達的影響Fig.5 Effect of sea cucumber cerebroside on mRNA expression of genes involved in Wnt/β-catenin signaling pathway in 3T3-L1 preadipocytes

由圖5可知，與對照組相比，海參腦苷脂可極顯著升高3T3-L1細胞分化第2、4、8天LRP5 mRNA的表達量（P＜0.01），可極顯著提高細胞分化第4、8天FZ1 mRNA的表達量（P＜0.01）。同時，海參腦苷脂可以顯著升高3T3-L1細胞分化第4、8天的β-catenin mRNA的表達水平，與對照組相比，第4天時β-catenin mRNA的表達量升高了64.7%，第8天時升高了141.2%（P＜0.01）。

2.6 海參腦苷脂對β-catenin表達及向核內轉移的影響

Wnt/β-catenin通路啟動之后，細胞質內β-catenin的積累逐漸增加，并轉移至細胞核中調控脂肪細胞分化[18]。21H7可以抑制β-catenin的表達。上述實驗結果已經證明海參腦苷脂可以通過Wnt/β-catenin通路抑制脂肪細胞的分化，所以進一步通過蛋白實驗研究海參腦苷脂對β-catenin向核內轉移的影響。

圖6 海參腦苷脂對β-catenin表達及向核內轉移的影響Fig.6 Effect of sea cucumber cerebroside on the expression and nuclear transfer of β-catenin

由圖6可知，與對照組相比，海參腦苷脂可升高β-catenin蛋白的表達量，并且可以極顯著促進其在核內的表達（P＜0.01）。21H7作用之后，細胞總β-catenin和核β-catenin的蛋白表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；海參腦苷脂對β-catenin蛋白表達的促進作用也受到抑制，但是其可以顯著改善21H7對總β-catenin的抑制作用（P＜0.0 5）。綜上所述，海參腦苷脂可以通過Wnt/β-catenin信號通路抑制3T3-L1細胞分化。

3 討 論

脂肪細胞在進入分化這一進程后，首先經歷細胞的擴增，同時體積變大，細胞質中開始出現載有脂質的液滴，經過一段時間后，脂滴會慢慢增大，并且聚結成一個或幾個脂滴[19]。脂肪細胞數量的增加以及體積的增大伴隨著更多TG的累積，Kim等研究發現，抑制TG合成酶相關基因的表達可以顯著降低脂質積累[20]。Huang等研究表明，上調脂肪生成相關基因導致TG含量的增加[21]。本實驗利用3T3-L1細胞研究了腦苷脂在前脂肪細胞增殖以及分化中發揮的作用，結果發現，海參腦苷脂可以明顯地阻抑前脂肪細胞的增殖，并且LDH實驗證明海參腦苷脂對前脂肪細胞沒有毒性作用；同時海參腦苷脂可以顯著降低脂肪細胞脂滴的聚集，降低脂肪細胞TG含量。以上研究說明海參腦苷脂可能具有降低脂質累積以達到減肥的目的。

脂肪細胞分化時很多轉錄因子會發揮各自的作用，這是一個精密復雜的轉錄級聯調節過程，目前研究認為調節脂肪形成的主要轉錄因子包括PPARγ、C/EBPα[22-24]。PPARγ屬于核內受體轉錄因子超家族，是重要的核心調節因子，具有調節脂肪形成、糖脂代謝和細胞增殖分化等生物學功能[25]。Rosen等證明PPARγ缺失的胚胎干細胞喪失脂肪細胞分化功能，說明PPARγ是脂肪細胞胚胎干細胞或胚胎成纖維細胞體外分化所必需的[26]。C/EBPα是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個亞家族成，在脂肪細胞分化、發育等諸多過程扮演著重要的角色[27]，并可激活眾多脂肪細胞分化相關基因的轉錄表達，同時促進細胞中脂肪的累積[28]。本研究表明，海參腦苷脂作用后，PPARγ mRNA和C/EBPα mRNA的表達水平明顯下降。說明海參腦苷脂可以通過降低PPARγ以及C/EBPα mRNA的表達水平，阻抑3T3-L1細胞的分化，從而減少脂質的積累。

Wnt/β-catenin這一通路被認為是前脂肪細胞分化最主要的負調控因子，Wnt/β-catenin通路啟動時，前脂肪細胞的分化受到抑制，而當信號關閉時，前脂肪細胞就會開始進行分化[29]。研究證明當Wnt信號通路激活時，Wnt與跨膜受體Frizzled（FZD）和LRP5/6相結合引發一系列反應，激活細胞內相關的蛋白，從而引起細胞核內β-catenin蛋白表達水平的改變[30]。Kennell等的研究也表明，Wnt抑制脂肪細胞的分化也可能是通過Fzd1介導的，激活Fzd1增加了β-catenin的穩定性，抑制了脂肪形成[31]。LRP5是一個單次跨膜蛋白，具有一個相對小的胞內區域以及一個包含了多個蛋白的大的胞外區域，其胞外區域介導Wnt與FZD的結合，從而形成三元復合物[32]。此外，LRP5還存在多個獨立的Wnt結合位點，可與多個Wnt同時結合，進而與FZD結合[33]。本研究結果表明，海參腦苷脂可以顯著降低LRP5和FZD mRNA的表達水平，通過Wnt/β-catenin信號通路抑制脂肪細胞的分化。而β-catenin作為Wnt/β-catenin通路的核心因子，它的積累量可直接影響Wnt/β-catenin通路發揮功能。研究發現，海參腦苷脂可以顯著升高β-catenin向核內轉移的情況。

綜上所述，海參腦苷脂可以顯著抑制3T3-L1細胞的增殖以及分化過程。其機制和脂肪細胞分化關鍵轉錄因子PPARγ、C/EBPα有關。并且可以通過增加FZD和LRP5的表達激活Wnt/β-catenin通路。同時，海參腦苷脂可以使β-catenin更加穩定，促進其向核內的移動來啟動Wnt/β-catenin通路。最終抑制前脂肪細胞的分化。