大果阿魏石油醚提取物成分分析及其對胃黏膜保護作用的評價

仲超逸，田洪磊*，詹 萍*，王 鵬，周文杰

（1.石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119）

當今社會快節奏的生活方式導致大多數人的飲食變得不規律、飲酒過量或頻繁服用各類藥物，這使得胃黏膜變得很脆弱且易受到損傷[1]。目前，對胃黏膜保護的手段主要有胃黏膜保護劑（如生胃酮、硫鋁糖等）[2]及具有健胃養胃功效的天然提取物，如能促進胃黏膜細胞增殖和DNA合成的丹參[3]、能提高胃組織中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和一氧化氮（NO）含量的鹽藻多糖等[4]。因此作為新疆特有的藥食兩用資源——大果阿魏在對胃腸道疾病輔助治療方面的功能性食品開發與研究具有良好的前景。

大果阿魏（Ferula lehmannii Boiss）屬于傘形科阿魏屬（Ferula），因具有強烈蔥蒜樣氣味常作為調味食材[5]。多種阿魏屬植物在民間已經廣泛用于抗驚厥、祛風、解痙、滋補、潤腸等方面，也能用于治療神經紊亂、糖尿病、風濕病和背痛等慢性疾病[6-8]，因此部分研究學者針對阿魏屬植物的主要化學成分進行了分離與鑒定，試圖獲得阿魏屬植物對胃部功能性修復的關鍵組分及明確具體的保護機理[9-10]。目前國內已有部分關于阿魏屬植物對胃腸道損傷修復功能的報道，如王颯[11]研究發現多傘阿魏的揮發油及其多種提取物對胃癌細胞增殖有一定的抑制作用；熊元君等[12]建立與臨床急性胃黏膜損傷相近的大鼠動物模型，比較并評價了烏恰阿魏、多傘阿魏和阿魏原汁對胃黏膜的保護及修復作用。然而針對新疆大果阿魏對胃黏膜保護作用的研究鮮見報道。

本實驗采用國內外常用的乙酸所致大鼠胃黏膜損傷模型，觀察大果阿魏石油醚提取物對胃黏膜損傷的修復作用，以損傷面積、損傷抑制率、胃組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）活力和PGE2、NO含量為指標，評價了大果阿魏石油醚提取物對胃黏膜的保護作用，同時將分離與鑒定提取物中的化學成分與各指標建立構效關系，為開發以大果阿魏為原料的具有養胃功能特性的食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SD（清潔級）雄性大鼠60 只，體質量180～220 g，由新疆醫科大學動物中心提供，許可證號：SCX（新）XJ-0001。

大果阿魏采摘于新疆石河子市南山紅土地帶（2017年4月），挑選出新鮮完整的地上部分后，迅速平鋪于空地并在室溫下自然陰干，在室溫下密封保存。

冰乙酸（分析純，乙酸含量≥99.5%） 天津市東麗區天大化學試劑廠；鹽酸雷尼替丁 山西太原制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na） 國藥集團化學試劑有限公司；SOD、MDA、PGE2、NO試劑盒 南京建成生物工程研究所；正構烷烴混合標準品（C7～C40） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

5977A氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；游標卡尺（量程0～125 mm，精密度0.02 mm） 上海精密儀器儀表有限公司；低溫離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 大果阿魏石油醚提取物制備

參考文獻[13]的方法，稱取干燥粉末100 g，加入8 倍體積的石油醚溶劑，水浴回流提取3 次，合并提取液，減壓抽濾得到上清液，用旋轉蒸發儀真空濃縮得到浸膏。

1.3.2 大果阿魏石油醚提取物成分分析

氣相色譜-質譜條件：H P-5色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度溫度60 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升高到230 ℃，保持10 min；載氣流量為1.0 mL/min，進樣量1 μL，不分流進樣。離子源為電子轟擊離子源，溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；掃描范圍30～450 amu。

定性定量方法：分離出的未知物各色譜峰與NIST 14 Library相匹配，為使化合物匹配更為精確，同時通過與文獻化合物中的相對保留指數（retention index，RI）進行比對驗證所鑒定的化合物。RI標準值為保留指數值，通過NIST數據庫（http：//webbook.nist.gov/chemistry/nameser.html）查閱得到。RI值根據式（1）計算。

式中：TR（m）、TR（m＋1）、TR（X）分別為碳原子數m、m＋1的正構烷和待測物X的保留時間，且通常TR（m）＜TR（X）＜TR（m＋1）。

1.3.3 大鼠乙酸性胃黏膜損傷模型的建立及分組

所有動物在相對濕度50%～60%、溫度23～25 ℃的動物房適應性喂養3 d，給予正常飲食自由飲水。

模型建立前12 h大鼠禁食不禁水，由于乙酸所致胃黏膜損傷與人類慢性胃黏膜損傷最相似，故采用Okabe等[14]的方法經過改良后制作乙酸損傷胃黏膜實驗大鼠模型。大鼠腹腔注射體積分數3%苯巴比妥鈉麻醉，劑量為0.18 mL/100 g。注射后約10 min完全麻醉，麻醉時間5 h左右。將大鼠固定在動物手術臺上，用碘酒、乙醇常規消毒，劍突下1 cm縱向切開皮膚，找出胃，移出腹腔，用微量注射器（5 μL）將胃前壁胃竇部膜下近肌層處注入體積分數20%冰乙酸0.05 mL，注射結束后，將胃復位，涂抹適量抗生素。術后當日將大鼠放回籠中，給予自由飲水，次日給予自由飲食。

造模完成后將大鼠隨機分成6 組，分別為正常組（未造模）、模型組、陽性組（雷尼替丁）及大果阿魏石油醚提取物高（1.0 g/kg mb）、中（0.2 g/kg mb）、低（0.04 g/kg mb）劑量組，每組8 只。

1.3.4 胃組織損傷面積及損傷抑制率的測定

給藥方法：術后次日開始給藥，正常組和模型組每天灌胃等體積的0.5% CMC-Na溶液；陽性組每天按照0.03 g/kg mb灌胃雷尼替丁；大果阿魏石油醚提取物高、中、低劑量組用0.5% CMC-Na混懸配制，大鼠給藥體積為1 mL/100 g mb，連續灌胃2 周。

末次給藥后，所有大鼠禁食12 h不禁水，處死后打開腹腔，結扎幽門和賁門，取出全胃。然后放入體積分數1%福爾馬林溶液中，用蒸餾水洗凈內容物，濾紙吸干，平展在玻璃板上，觀察損傷愈合情況，用游標卡尺量取損傷部分的最大縱徑和橫徑，分別根據式（2）、（3）計算損傷面積及損傷抑制率。

1.3.5 胃組織病理切片觀察

胃組織病理切片觀察參考文獻[15]。用體積分數4%甲醛溶液固定各組胃組織，用流水沖去固定液后放入體積分數70%的乙醇溶液中保存。將各胃組織依次置于不同體積分數的乙醇中梯度脫水至組織塊完全脫水透明，然后進行包埋、切片、染色，于顯微鏡下觀察。

1.3.6 胃組織生化指標的測定

各組取損傷邊緣相同部位的一塊胃組織，稱取0.3～0.4 g，用質量分數0.9%的冰生理鹽水制備成10%的組織勻漿，離心后取上清液，置于4 ℃下測定SOD活力、MDA含量、PGE2質量濃度及NO含量。

1.3.7 主成分分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種較為經典的特征抽取和降維技術之一，同時在無監督的模式下對各因素進行分類與可視化識別[16]。以所測指標即SOD、MDA、PGE2和NO水平為分類變量，對提取物中的揮發性物質進行分類。依據PCA分析的基本原則，即各化合物在得分圖上距離越接近某項指標，其對于該指標的貢獻率越大。

1.4 數據處理與分析

測定結果及主成分分析均采用SPSS 19.0軟件，數據以fs表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 大果阿魏石油醚提取物成分分析

采用氣相色譜-質譜分析得到大果阿魏石油醚提取物的總離子流圖如圖1所示，共鑒定出25 種成分，結果詳見表1。大果阿魏石油醚提取物中主要有萜類及含硫化合物。相對含量最高的是萜類物質，玫瑰醚、側柏醇、橙花醇3 種單萜和馬兜鈴烯、橙花叔醇等10 種倍半萜相對含量為49.47%，其中橙花叔醇、玫瑰醚相對含量較高，分別為8.70%和6.59%。1-(1-(甲硫基)丙基)-2-丙基二硫醚（10.88%）、(Z)-仲丁基丙烯基二硫醚（7.52%）、(Z)-2-丁烯基1-甲基丙二硫醚（3.73%）和二甲基三硫醚4 種含硫化合物相對含量為24.01%，這些含硫物質的存在賦予了大果阿魏特殊的蔥蒜樣氣味[17]。

圖1 大果阿魏石油醚提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatography of the petroleum ether extract from Ferula lehmannii Boiss

表1 大果阿魏石油醚提取物成分分析Table1 Chemical composition of the petroleum ether extract from Ferula lehmannii Boiss

2.2 大果阿魏石油醚提取物對大鼠體質量的影響

大鼠體質量的變化是評價提取物是否具有毒性的一個重要指標，由表2可知，空白組、模型組、陽性組及大果阿魏石油醚提取物高、中、低劑量組間大鼠的初始體質量無顯著差異（P＞0.05）。經過灌胃給藥2 周后，各組間大鼠體質量無顯著性差異（P＞0.05），可以說明大鼠在受試過程中正常生長，未受到大果阿魏提取物的影響。

表2 大鼠體質量（n＝8）Table2 Body mass of rats (n= 8)

2.3 大果阿魏石油醚提取物對乙酸所致大鼠胃黏膜損傷的影響

圖2可以直觀地體現出不同實驗組胃黏膜損傷面積的變化情況。與空白組相比，模型組胃黏膜損傷程度最嚴重，損傷面積達到41.14 mm2。經過灌胃給予不同劑量的藥物及提取物干預后，胃黏膜損傷呈現出不同程度的修復。其中，陽性組損傷面積為27.78 mm2，相比于模型組減小了13.36 mm2，抑制率達到32.47%；大果阿魏石油醚提取物高劑量組（1.0 g/kg）的損傷面積為28.04 mm2，相比于模型組減小了13.10 mm2，抑制率達到31.84%，效果與陽性組差異不明顯。低劑量組對胃黏膜損傷也有一定的修復作用，其損傷抑制率達到18.67%，但與高劑量組相比，修復能力相對較弱。中劑量組對受損胃黏膜的修復作用介于低劑量組及高劑量組之間，高劑量組與中、低劑量組對胃黏膜的修復能力存在顯著差異。然而通過胃黏膜損傷面積的測量無法明確提取物中的物質成分與胃黏膜修復之間存在何種作用效果，因此需要對大鼠胃組織中的生化指標進行測定，從而明確具體的構效關系。

圖2 大果阿魏石油醚提取物對大鼠胃黏膜損傷面積和損傷抑制率的影響Fig.2 Inf l uence of the petroleum ether extract from Ferula lehmannii Boiss on gastric mucosal injury area and injury inhibition percentage

2.4 大鼠胃黏膜損傷的組織病理學分析

圖3 各組大鼠胃組織HE染色切片Fig.3 Microscopic observation of stomach tissues of rats

如圖3所示，空白組大鼠胃壁結構正常，胃黏膜各層次清晰，胃腺呈管狀整齊有序，可以看見正常的黏膜柱狀細胞和完整的腺細胞，無炎性細胞浸潤；與此形成對比的是，模型組大鼠胃黏膜破壞嚴重，損傷已經到達肌層，表面黏膜上皮細胞脫落，可見充血、水腫且有大量炎細胞浸潤。缺口處有較少的黏膜再生，組織結構較為紊亂。相比于模型組，陽性組及提取物組胃黏膜組織形態存在較大差異。陽性組損傷部位愈合現象明顯，有新生上皮細胞覆蓋在損傷處，炎性細胞減少并有新生腺體。低劑量組大鼠胃黏膜缺損程度依然較為嚴重，損傷累及肌層，有出血、淤血現象；中劑量組和高劑量組大鼠表現出胃黏膜中度再生，損傷底部可見新生的肉芽組織，高劑量組大鼠新生的腺體覆蓋在損傷部位，并出現許多新生的結締組織，仍有少量炎性細胞浸潤，但愈合趨勢明顯。

2.5 大果阿魏石油醚提取物對乙酸所致大鼠胃黏膜損傷胃組織生化指標的影響

表3 大果阿魏石油醚提取物對大鼠胃組織生化指標的影響（n＝ 8）Table3 Effect of the petroleum ether extract from Ferula lehmannii Boiss on biochemical indexes of gastric tissue in rats (n= 8)

如表3所示，與空白組相比，乙酸引起的胃黏膜損傷使得大鼠胃組織中SOD活力下降而MDA活力上升。與模型組相比，高劑量組中SOD活力顯著增加37.27%（P＜0.05），與陽性組SOD活力增加程度（41.84%）較為接近；高劑量組M D A含量減少了3 2.5 1%（P＜0.05），陽性組減少了33.25%。中、低劑量組這兩個指標的活力發生變化但差異性不顯著。說明高劑量提取物能明顯提高自由基的清除能力，從而加快胃黏膜修復進程。乙酸刺激大鼠胃部后胃組織中PGE2和NO含量都有所下降。與模型組相比，陽性組中PGE2和NO含量顯著增加了30.79%和56.49%。經過提取物干預后，各組大鼠胃組織中PGE2和NO含量增加。其中，高劑量組大鼠PGE2增加了22.41%，NO增加了28.13%，但并無明顯影響。由此可見，提取物對胃黏膜保護因子的增強作用并不顯著，其對胃黏膜損傷的修復作用主要是由于存在的抗氧化物質能夠有效地清除各種自由基，提高了胃黏膜的抗氧化能力。為了更進一步明晰提取物中化合物和所測生化指標間的內在聯系，從而確定胃黏膜修復機理，采用PCA法構建了已鑒定化合物與各生化指標的相關性模型。

2.6 PCA分析

PCA屬于無監督判別模式[18]，因此所構建PCA模型分析提取物中化合物和抗氧化因子及胃黏膜保護因子之間的關系是客觀科學的，具體結果如圖4所示。

圖4 提取物中化合物與指標間的PCA分析Fig.4 Principal component analysis plots of chemical composition and biochemical indexes

PCA模型中PC1（58.78%）和PC2（26.39%）累計方差貢獻為85.71%，可以反映化合物的大部分信息，因此保留PC1-PC2主成分的化合物分布圖。根據PCA分析的基本原則，即化合物與指標在得分圖上距離越近，化合物對于該指標的貢獻率就越大。由圖4可以看出，各指標與成分分布在X軸中軸線兩側，且分布具有明顯的區分度。以圖中中軸線為界，代表抗氧化能力的SOD與MDA分布在左半邊，代表胃黏膜修復因子指標的NO與PGE2分布在圖的右邊，且各參數間能夠明顯地區分開。其中，SOD附近主要聚集了包括對乙烯基愈創木酚、愈創木醇、橙花叔醇等在內的6 種化合物，這些物質對于自由基的清除有顯著影響。例如苯乙醛除存在于竹葉、木瓜籽等多種植物具有抗氧化活性的揮發油中，還廣泛存在于啤酒中，其含量的增加可以提高啤酒的還原力[19]；馬士巧[20]以抗菌和抗氧化活性為指標，篩選了東北黑蜂蜂膠中的極性活性物質并進行分析，發現愈創木醇為其主要的活性物質。MDA周圍主要成分是紫羅蘭酮、石竹烯氧化物、桉葉油醇及兩種含硫化合物（(Z)-2-丁烯基1-甲基丙二硫醚、1-(1-(甲硫基)丙基)-2-丙基二硫醚）。陳景明等[21]發現石竹烯氧化物為赤楠葉揮發油中的主要成分并評價了其抗氧化性及抗氧化效果；桉葉油醇具有良好的抗氧化及抗菌活性存在于多種植物的精油中[22]。(Z)-2-丁烯基1-甲基丙二硫醚和1-(1-(甲硫基)丙基)-2-丙基二硫醚廣泛存在于新疆阿魏中，但鮮有研究表明其抑制脂質過氧化活性。綜上所述，桉葉油醇及石竹烯氧化物對于MDA活性的減少起到關鍵的積極作用。除環氧十六烷外，沒有與NO和PGE2距離相近的化合物，可能是由于各組分與各生化指標間的相關性評價是一個十分復雜的體系，單純的采用一種判別模式無法全面揭示出全部的內在關聯，僅僅從二維PCA圖以PC1-PC2為坐標軸，只是在無監督的判別模式下得出較為全面的相關性模型，因此研究與NO和PGE2指標最大相關性成分，有待后期更進一步深層次的數據分析及模型構建。

3 討 論

國內外很多學者對阿魏屬植物的揮發油進行研究，結果表明該屬多種植物的不同部分的揮發油具備良好的抗菌性及抗氧化性。Iranshahi等[23]發現從F. latisecta果實中提取出的揮發油存在大量硫化物，對革蘭氏陽性菌尤其是金黃色葡萄球菌有著顯著的抑制活性；Kavoosi等[24]提取并分析了3 批不同時間采集的F. assa-foetida的揮發油，發現（Z/E）-仲丁基丙烯基二硫醚、β-蒎烯及桉葉油醇為其主要的化合物，并且提取的揮發油對自由基具有良好的清除能力。通過對阿魏草石油醚提取物物質組成分析，可以看出提取物中所含大量萜類化合物，這些物質具有許多生理活性。如愈創木醇廣泛存在于植物的揮發油中，具有抗菌、抗氧化等功能[25]；王慧英等[26]的研究表明，玫瑰精油中存在的玫瑰醚等物質不僅賦予其天然的香味，更是具有很好的抗氧化活性；石竹烯、橙花叔醇等倍半萜類物質存在于很多藥用植物中，這些植物的揮發油具有良好的抗菌、抗腫瘤活性[27]。含硫化合物也是阿魏草石油醚提取物中物質的重要組成部分。有研究表明，二甲基硫醚作為催化抗氧化體系的重要小分子底物，在氧化應激條件下，可以快速和活性氧反應生成二甲基亞砜，從而發揮其抗氧化作用[28]。

乙酸性胃黏膜病變的起源是一個多因素的過程，主要是由于胃壁黏液的消耗，這種消耗經常與自由基的含量顯著相關，結果導致黏膜損傷，包括潰瘍、糜爛、出血。氧自由基，主要是羥自由基、超氧化物陰離子自由基和脂質過氧化物，是導致胃黏膜損傷的有害化合物[29]，抗氧化能力及胃黏膜防御因子的含量對胃黏膜的保護意義重大。乙酸性胃黏膜損傷程度與自由基的含量顯著相關。正是由于如羥基自由基、超氧化物陰離子和脂質過氧化物等大量氧自由基的存在使胃黏膜損傷加劇。SOD是體內清除自由基的首要物質，它能夠對抗和阻斷由于氧自由基對細胞造成的損傷并及時修復受損細胞[30]，是生物體內重要的抗氧化酶。而MDA是一種重要的脂質過氧化產物，其含量增加會破壞細胞膜的完整性增加通透性，從而引起組織損傷[31]。PGE2和NO被認為是胃黏膜保護因子，PGE2具有通過影響黏膜上皮細胞的增殖、黏液生成和黏膜血液供應來保護胃黏膜[32]。NO能夠使黏膜血管擴張，也可以有效地調節胃黏膜保護因子及胃酸、酸根等損傷因子，同時增加胃黏膜血流量達到胃黏膜防御作用[33]。本實驗的結果表明，大果阿魏石油醚提取物能明顯提升大鼠胃黏膜中SOD活力，降低MDA含量。隨著用藥劑量增加，其作用效果愈明顯，相比模型組，提取物高劑量組效果更加明顯。

綜上，大果阿魏石油醚提取物具有明顯的促進損傷胃黏膜修復的作用，且治療效果接近雷尼替丁。潛在的作用機制主要是通過提高胃黏膜的抗氧化能力，提高SOD活力，降低MDA含量，加快胃黏膜的增殖與修復，從而達到保護胃黏膜的作用。