桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠血糖血脂和抗氧化能力的影響

王祖文，秦櫻瑞，黃先智，丁曉雯,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400716；2.西南大學科技處，重慶 400716）

隨著社會環境和飲食習慣的改變，肥胖、高血糖和高血脂等發病率逐年上升，這些疾病已嚴重危害人類健康[1]。許多藥食同源的中藥材因含多種具有治療疾病和預防保健作用（如降糖、降脂、增強免疫力、抗衰老等[2-3]）的活性成分而受到人們青睞。從植物資源中開發一些適用一般人群的食品來調節機體功能、減少疾病發生的風險成為近年研究熱點。

桑葉、苦瓜均是藥食兩用植物。大量研究證明，桑葉富含多糖、生物堿、黃酮等功能成分[4]，具有降糖[5-6]、降脂[7-9]、抗氧化[10]等諸多生理功能；苦瓜富含多糖、皂苷和多肽等活性成分，具有降糖[11-12]、降脂[13-14]、抗氧化[15]、抗菌[16]等作用。目前關于桑葉、苦瓜及其提取物降糖、降脂、抗氧化效果的研究已有諸多報道，如Ahmed等[17]報道苦瓜提取物對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠具有降脂、降糖作用；杭悅宇等[18]報道，苦瓜凍干粉對四氧嘧啶誘導的高血糖小鼠具有良好的降糖作用；Andallu等[19]在STZ誘導的糖尿病大鼠的食物中添加25%（質量分數）干桑葉粉，發現其能抑制糖尿病大鼠肝組織脂質過氧化和過氧化氫酶的活性，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性；Jeszka-Skowron等[6]用桑葉干粉的乙醇提取物灌胃STZ誘導的非肥胖II型糖尿病大鼠，結果表明桑葉具有降血糖、提高胰島素水平及抗氧化功能。

近幾年，本實驗室也進行了相關的研究，如鄒莉芳等[20]發現桑葉水提物（主要含桑葉生物堿）對高脂飲食小鼠有顯著降血脂作用，能有效減少脂肪積累，促進膽固醇代謝；方太松等[21]研究了不同劑量桑葉超微粉奶茶灌胃alloxan誘導的糖尿病小鼠，能顯著降低實驗小鼠總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）和低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）濃度，升高高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）濃度；李玲等[22]研究了桑葉-苦瓜混合粉的體外抗氧化能力，結果表明桑葉-苦瓜在體外抗氧化有協同增效作用；楊敏等[23]報道桑葉-苦瓜混合粉可顯著降低糖尿病小鼠TC、TG和LDL-C濃度，升高HDL-C濃度；彭曉蝶等[24]對糖尿病小鼠灌胃不同質量濃度的桑葉-苦瓜混合粉，發現當質量濃度為0.20 g/mL，灌胃30 d后，與模型組相比，糖尿病小鼠體質量下降受到顯著抑制，血糖濃度下降率超過40%，肝糖原濃度增加1 倍以上。

桑葉、苦瓜無論是單獨還是混合喂飼都對糖尿病實驗動物、高脂飲食實驗動物均有顯著的降糖、降脂、抗氧化作用，特別是混合喂飼能極顯著降低糖尿病小鼠血糖，對肝糖原儲存能力的增強作用優于二甲雙胍（降血糖藥物）[23-24]。但長期攝入桑葉-混合苦瓜粉對正常實驗動物的血糖、血脂、抗氧化能力是否有調節作用，是否會造成正常動物低血糖等還鮮見報道。為了驗證桑葉、苦瓜混合粉對正常實驗動物無不利影響，本實驗利用桑葉-苦瓜混合粉喂飼正常小鼠，測定其血糖、血脂水平及抗氧化指標并進行分析，以期為桑葉、苦瓜混合粉相關功能保健食品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明種清潔級小鼠，體質量25～30 g，購自重慶滕鑫有限責任公司，許可證號：SCXK（渝）2007-006。基礎飼料購自重慶滕鑫有限責任公司。

桑葉品種為勝利大葉，由重慶市蠶業科學技術研究院提供，75 ℃熱風干燥60 min，粉碎備用[25]（干燥桑葉粉中水分4.45%（質量分數，下同）、DNJ含量227.47 mg/100 g、黃酮含量49.51 mg/g、多糖11.29%）；苦瓜品種為綠玉，購于北碚雄風超市，60 ℃熱風干燥8 h，粉碎備用[26]（干燥苦瓜粉中含水分1.22%、皂苷2.31%、多糖7.43%、多肽0.11%）。

穩捷型血糖試紙 美國LifeScan公司；糖原測定試劑盒、SOD測定試劑盒（WST-1法）、GSH-Px測定試劑盒、MDA測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；TC測定試劑盒、TG測定試劑盒、LDL-C測定試劑盒、HDL-C測定試劑盒 四川邁克生物科技股份有限公司；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）（分析純） 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

7020型全自動生化分析儀 日本日立公司；Model680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；ONE TOUCHTMBasicTMPlus穩捷基礎倍加型血糖監測儀 美國LifeScan公司；S22可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；5810型臺式高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉-苦瓜混合粉的制備

根據前期實驗結果[24]，將桑葉粉、苦瓜粉按3∶1的質量比混合后，各取5、10、15、20 g混合粉分別溶入100 mL 0.01g/mL的CMC-Na水溶液中，得到質量濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL的桑葉-苦瓜混合液。

1.3.2 小鼠的分組與喂養

實驗小鼠于西南大學食品科學學院動物實驗房內飼養，室溫（23f1）℃，相對濕度約60%，12 h光暗交替處理（7∶00ü19∶00）。實驗用正常小鼠100 只，隨機分為5 組，每組20 只，雌雄各半，自由進食飲水，適應性喂養1 周。各組小鼠均給予基礎飼料喂養，LD組（低劑量組）、MD組（中劑量組）、HD組（高劑量組1）、GD組（高劑量組2）小鼠分別灌胃質量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL桑葉-苦瓜混合粉0.5 mL/d，連續灌胃30 d；NC組（對照組）灌胃同等體積的0.01 g/mL CMC-Na。

1.3.3 實驗樣品采集

1.3.3.1 血清采集與制備

實驗小鼠灌胃30 d后，禁食不禁水12 h，完成尾靜脈采血測定血糖值后，摘眼球取血，參照Tsuduki等[27]的方法制備血清，收集上清液，分裝后于－80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3.2 肝勻漿的制備

采血完畢后的小鼠頸椎脫臼處死，打開胸、腹腔，取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，濾紙拭干，稱質量。準確稱取一定量的肝臟樣品，加入9 倍體積的生理鹽水，在冰浴上研磨制備肝勻漿，于3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后于－80 ℃冰箱保存備用。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 小鼠的體質量測定

在小鼠灌胃前及灌胃后的第6、12、18、24、30天分別測定小鼠的體質量，按公式（1）計算體質量增長率[28]。

式中：m0為小鼠初始體質量/g；m1為喂飼一定時間后小鼠體質量增加量/g。

1.3.4.2 血糖濃度測定

實驗小鼠灌胃前和灌胃第15、30天禁食不禁水12 h，用血糖儀測定小鼠空腹血糖濃度。按公式（2）計算血糖下降率[29]。

式中：I1為灌胃前血糖濃度；I2為灌胃后血糖濃度。

1.3.4.3 糖耐量測定

各組小鼠在末次灌胃前禁食不禁水12 h后，尾靜脈取血測定血糖作為空腹血糖濃度；灌胃3 h后經口給予葡萄糖2.5 g/kg mb，分別于注射后0.5、1.0、2.0 h尾靜脈采血測血糖濃度。參考《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）[30]，按公式（3）計算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）。

式中：cA為空腹血糖濃度/（mmol/L）；cB、cC、cD分別為腹腔注射葡萄糖0.5、1.0、2.0 h后血糖濃度/（mmol/L）。

1.3.4.4 血清及肝勻漿肝糖原、血脂、抗氧化指標測定

采用全自動生化分析儀按照試劑盒說明書測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度；采用酶標儀按照試劑盒說明書測定肝勻漿中肝糖原含量、SOD、GSH-Px活力及MDA含量。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析，實驗結果以fs表示，采用Duncan顯著性差異檢驗進行單因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＜0.001為差異高度顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠體質量的影響

體質量能衡量動物包括人的健康狀況，超重、肥胖或體質量過輕都不是健康的表現。以小鼠體質量增長率為指標，考察用桑葉-苦瓜混合粉喂飼一定時間對小鼠體質量的影響。

表1 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠體質量增長率的影響Table1 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on body mass gain in normal mice

由表1可知，在實驗過程中，所有小鼠體質量均有增加且雄鼠的增長率高于雌鼠，隨著桑葉-苦瓜混合粉灌胃質量濃度的增加，正常小鼠體質量增長率逐漸減小并趨于平緩。當灌胃質量濃度為0.15 g/mL，雌、雄鼠的體質量增長率分別為11.26%、18.55%，與NC組相比差異極顯著（P＜0.01），說明桑葉-苦瓜混合粉對雌雄小鼠的體質量有顯著抑制作用；當質量濃度增加到0.20 g/mL時，抑制作用趨于穩定，與HD組（0.15 g/mL）的體質量增長率無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，桑葉-苦瓜混合粉對正常雌雄小鼠的體質量增加有較好的控制作用。

2.2 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠血糖濃度的影響

血糖值反應了胰島β細胞對胰島素的分泌功能。桑葉、苦瓜均具有降血糖的作用，為考察桑葉-苦瓜混合粉是否會引起正常小鼠血糖濃度過多降低，測定了不同質量濃度桑葉-苦瓜混合粉灌胃30 d對正常小鼠血糖濃度的影響。

表2 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠血糖濃度的影響Table2 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on blood glucose in normal mice

由表2可知，NC組小鼠的血糖濃度一直維持在6.22～7.58 mmol/L范圍內，相對穩定。與NC組相比，隨著灌胃桑葉-苦瓜混合粉時間的延長和質量濃度的增加，各組小鼠血糖濃度有一定下降，但也維持在4.78～6.46 mmol/L范圍內，本實驗結果與董英[31]、玄光善[32]等研究中昆明種正常小鼠血糖濃度分別為（5.56f1.21）、（5.05f2.37）mmol/L）接近。結果表明，正常小鼠長時間服用桑葉-苦瓜混合粉，血糖濃度仍維持在正常范圍，不會出現低血糖。

2.3 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠糖耐量的影響

糖耐量即對葡萄糖的耐受能力。正常人服用一定量葡萄糖后，血糖濃度先升高，經過一段時間的代謝，葡萄糖在機體合成糖原并加以貯存，血糖濃度恢復到空腹水平。若服糖2 h后血糖濃度仍然保持較高水平，說明糖耐量能力降低，即機體對糖的吸收利用低于正常人[33]。此外，AUC反映葡萄糖被人體利用程度和清除情況，其值增大說明機體糖耐量能力下降，反之則糖耐量能力升高[24]。

表3 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠糖耐量的影響Table3 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on glucose tolerance in normal mice

由表3可知，N C組小鼠0 h血糖濃度為（6.64f0.67）mmol/L，注射葡萄糖后2 h其血糖濃度為（5.94f0.51）mmol/L，與空腹血糖濃度比差異無顯著性（P＞0.05），AUC為12.62f0.44，表明NC組小鼠對糖吸收和利用正常。喂飼不同質量濃度桑葉-苦瓜混合粉均能不同程度地降低正常小鼠葡萄糖負荷后的血糖濃度，降低AUC，提高正常小鼠糖耐量。與NC組比較，HD組雌、雄鼠餐后AUC別為10.13f0.62、10.39f0.50（P＜0.001），達到最低，下降率分別為19.73%、18.51%。結果表明，不同質量濃度桑葉-苦瓜混合粉均能顯著降低小鼠餐后2 h血糖濃度，具有提高正常小鼠糖耐量的作用。

2.4 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠肝糖原含量的影響

當血糖升高時可在肝臟合成糖原，血糖降低，肝糖原將分解為葡萄糖以補充血糖。因此，肝糖原對維持血糖穩定十分重要[34]。正常飲食能不斷補充肝糖原，減少糖原的異生作用。肝糖原的合成和降解受到胰島素的控制，當胰島素控制失調，肝糖原的合成也會失調[35]。

表4 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠肝糖原含量的影響Table4 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on hepatic glycogen level in normal mice

由表4可知，N C組小鼠肝糖原含量維持在2.37～2.43 mg/g。隨著灌胃桑葉-苦瓜混合粉質量濃度的增加，小鼠肝糖原含量隨之增加，呈現明顯的劑量-效應關系。與NC組相比，GD組雌、雄小鼠肝糖原含量分別增長了1.93、1.98 倍。結果表明，桑葉-苦瓜混合粉能增加正常小鼠肝糖原的合成，有助于實驗小鼠血糖濃度保持在穩定水平。

2.5 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠血脂濃度的影響

血脂是血漿中所含脂類的總稱，主要包括膽固醇和甘油三酯，血脂變化可反映體內脂質代謝的情況。血脂水平的升高與動脈粥樣硬化的發生有關，尤其是當LDL-C濃度過高，其沉積于動脈血管壁形成粥樣斑塊；HDL-C可把動脈壁上的膽固醇逆向轉運到肝臟中進行代謝后排出體外，從而減少膽固醇在動脈壁上的沉積[36]。在一定程度上降低LDL-C、升高HDL-C濃度有助于預防動脈粥樣硬化[37]。

表5 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠血脂濃度的影響Table5 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on blood lipids in normal mice mmol/L

由表5可知，與NC組相比，隨著桑葉-苦瓜混合粉灌胃質量濃度的增加，正常小鼠血清TC、TG、LDL-C濃度下降，HDL-C濃度上升。各組之間的LDL-C、HDL-C濃度存在高度顯著差異（P＜0.001），呈現劑量-效應關系。與NC組相比，GD組雌鼠TC、TG、LDL-C濃度分別下降17.19%、15.00%、41.67%（P＜0.01，P＜0.001），雄鼠TC、TG濃度無顯著變化，LDL-C濃度下降45.83%（P＜0.001）；雌、雄鼠HDL-C濃度分別上升64.52%、72.22%（P＜0.001）。結果表明，桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度有調節作用，特別是對LDL-C、HDL-C濃度影響明顯。

2.6 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠抗氧化能力的影響

抗氧化物質可減少機體自由基的產生，降低自由基的副作用。SOD、GSH-Px、MDA是常用的反映組織抗氧化能力和氧化損害程度的指標，其中MDA是脂質過氧化反應的主要代謝產物，可嚴重破壞細胞膜結構；而SOD、GSH-Px等構成了機體重要的抗氧化酶系統，可減少氧自由基的產生，防止脂質過氧化及其中間代謝產物對機體的損害[38-39]。研究表明，桑葉、苦瓜單獨使用均能增強糖尿病鼠的抗氧化能力[40-41]。桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠肝臟抗氧化能力影響的結果如表6所示。

表6 桑葉-苦瓜混合粉對正常小鼠抗氧化指標的影響Table6 Effect of mulberry leaf and bitter melon powder blend on hepatic antioxidant parameters in normal mice

由表6可知，與NC組相比，隨著桑葉-苦瓜混合粉灌胃質量濃度的增加，正常小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力隨之增強，MDA含量逐漸減少。各組之間的SOD、G S H-P x活力、M D A含量存在高度顯著差異（P＜0.001），呈現明顯的劑量-效應關系。與NC組相比，GD組雌鼠SOD、GSH-Px活力分別上升41.77%、29.04%（P＜0.001），MDA含量下降36.71%（P＜0.001）；雄鼠SOD、GSH-Px活力分別上升48.41%、27.21%（P＜0.001），MDA含量下降37.73%（P＜0.001）。結果表明，一定劑量的桑葉-苦瓜混合粉可增強正常小鼠的抗氧化能力，減少脂質過氧化物的產生，保護細胞免受氧化損傷，保證肝臟脂質代謝正常。

3 討 論

本實驗室前期研究表明，桑葉-苦瓜聯合作用對糖尿病小鼠具有很強的降糖、降脂功能[23-24]。桑葉主要活性成分多糖、生物堿對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，在高質量濃度下具有協同作用[42]，進而發揮降血糖的作用。桑葉中的黃酮類物質一方面可作為α-葡萄糖苷酶抑制劑[43]，另一方面可作為胰島素促分泌劑來降低血糖水平[44]。苦瓜皂苷對α-葡萄糖苷酶雖無抑制，但能顯著提高正常小鼠糖耐量，恢復胰島β細胞的活力，刺激肝糖原合成同時抑制肝糖原釋放，提高機體肝糖原的貯存能力[45]。苦瓜皂苷還能夠增強巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α，誘導和增強SOD和GSH-Px的活力。此外，桑葉和苦瓜均富含多酚類物質，因其具有清除自由基、增強抗氧化能力的作用，可保護機體免受氧化應激的傷害，能有效預防動脈粥樣硬化等心血管疾病的發生[46]。

鑒于桑葉、苦瓜兩種藥食同源植物對糖尿病及高脂血癥小鼠均具有降糖、降脂、抗氧化的功效，為了驗證桑葉、苦瓜混合使用對正常實驗動物無不利影響，本實驗采用桑葉-苦瓜混合粉喂飼正常小鼠，實驗結果顯示，隨著灌胃質量濃度增加和時間延長，桑葉-苦瓜混合粉能有效地控制小鼠的體質量增長；不會引起正常小鼠低血糖，同時還能提高正常小鼠血糖調節能力，促進肝糖原合成；此外，一定質量濃度的桑葉-苦瓜混合粉可調節小鼠血脂濃度，有效預防高血脂癥，增強抗氧化能力，保護肝臟細胞免受氧化損傷，保證肝臟脂代謝的穩定性。這些結果均表明桑葉和苦瓜混合飼喂對正常實驗動物并無不利影響，這為桑葉、苦瓜混合粉開發相關功能保健食品的適用性提供了參考依據。