黃酒通過腸肌間神經叢抑制大鼠離體小腸的收縮

王 聰，趙 盼，周亞男，王天霞，孫海基*

（山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014）

黃酒是我國歷史悠久的傳統釀造酒，其以獨特的復式發酵工藝釀造，與啤酒、葡萄酒并列成為世界三大釀造酒。黃酒內含有豐富的碳水化合物、氨基酸、維生素、微量元素、酚類、黃酮類、生物活性肽等多種活性物質，適量常飲有助于血液循環，有促進新陳代謝、舒筋活血、強身健體、延年益壽等功效[1-3]。黃酒的保健功能歷來倍受推崇，但是與紅酒、葡萄酒、清酒相比，對黃酒的研究大多集中在理化檢測和發酵工藝等方面，對黃酒的保健功效缺乏深入科學的研究。謝廣發的研究認為黃酒具有排鉛、增強學習記憶能力、增強免疫能力、延緩衰老、抗氧化、提高耐缺氧能力等多種保健功能[3]。沈赤通過研究免疫缺陷小鼠發現，黃酒可以有效提高免疫缺陷小鼠的免疫功能[4]。中醫認為，適量飲用黃酒具有通曲脈、厚腸胃、養脾氣、扶肝、除風等多種保健生理功能。本課題組通過小鼠游泳和亞急性衰老小鼠模型實驗分別探討了黃酒對抗疲勞能力以及亞急性衰老小鼠免疫器官的作用，結果表明黃酒能提高小鼠的抗疲勞能力，增強衰老小鼠的免疫能力[5]。但黃酒對胃腸生理功效的影響，還鮮有報道。本研究用低、中、高劑量的黃酒和去多酚黃酒分別處理大鼠離體的小腸，觀察黃酒對小腸收縮的影響，用免疫組化和Western blot技術檢測大鼠腸肌間神經叢乙酰膽堿轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）和一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）蛋白的表達，探討其可能的影響機制，進一步明確黃酒保健養生的功效和機制，為黃酒價值的提升和黃酒的推廣提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性Wistar大鼠，體質量200～220 g，由山東大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（魯）2013-0009，控制室溫（20f5）℃飼養，動物自由飲水和攝食。

黃酒（乙醇體積分數為8%）由河北省農林科學院谷子研究所提供；小米篩選除雜、浸漬、瀝水、蒸煮、冷卻，添加酒曲化酵母發酵，最后壓榨、澄清、過濾獲得產品[6]。

免疫組化檢測試劑盒 北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

WD-9405B型水平搖床 北京市六一儀器廠；HW-200S恒溫平滑肌實驗系統 成都泰盟軟件有限公司；RM6240多道生理信號采集處理系統、HH-S2型數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠；SartoriusAG BS200S-WE1精密電子天平、BS型電子天平 德國塞多利斯公司；光學顯微鏡、YM200數字攝像機 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒對大鼠離體小腸收縮的影響

大鼠經饑餓處理后，頸椎脫臼法處死，迅速沿腹正中線剖開腹部，取小腸，用預冷的臺氏液洗凈腸段內容物，剪成約1.5 cm長的腸段備用。小腸段兩端用細線結扎，一端的結扎線固定于進氣支架上，腸段的另一端結扎線與張力換能器相連，適當調節換能器的位置與高度，使離體小腸段垂直懸浮于實驗管中央，避免與管壁內側接觸而影響實驗結果，讓腸段在實驗管內穩定15 min后記錄小腸的收縮曲線。先記錄5 min的正常收縮曲線，分別用低（1.5%（體積分數，下同））、中（3.5%）、高（10.0%）劑量的黃酒，乙醇溶液和去多酚黃酒處理，記錄給藥后5 min的收縮曲線。收縮曲線離開基線，上升達峰頂后下降回到基線的過程稱為一次收縮，峰頂和基線之間的幅度即為該收縮波的收縮幅度，完成一次收縮所用的時間即為收縮時程。統計加藥前1 min和加藥后第2分鐘的收縮曲線的幅度和頻率。

1.3.2 小腸肌間神經叢ChAT和NOS陽性神經元的表達

1.3.2.1 免疫組織化學技術檢測肌間神經叢蛋白的表達

取臺氏液組和低、中、高劑量黃酒組的腸段，向腸管中灌入固定液（體積分數4%多聚甲醛和0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）配制）充盈腸段，4 ℃固定6～8 h，隨后用質量分數20%的蔗糖溶液（PBS溶解）4 ℃脫水至腸管下沉，撕片法剝離腸段縱肌層，置于盛有0.01 mol/L pH 7.4 PBS中，備用。

用PBS沖洗腸片置于體積分數3%過氧化氫-甲醇溶液中室溫孵育后，用0.01 mol/L PBS洗滌，加封閉液（0.01 mol/L PBS、正常山羊血清原液、質量分數10% Triton X-100）封閉，用1∶500兔抗ChAT抗體和1∶300兔抗NOS一抗、二抗處理。顯色，貼片，自然風干，經脫水、透明后封片。晾干后的裝片物用互動實驗室數字顯微圖像處理系統軟件（配有YM200數字攝像機、MiE3.1顯微圖像處理軟件）10h10 倍觀察并拍照。

1.3.2.2 Western blot檢測小腸肌間神經叢蛋白表達

取小腸段，4 ℃臺氏液清洗，濾紙吸去水分，將組織放入預冷的1.5 mL離心管里，加入適量RIPA裂解液，用電動研磨器裂解蛋白，裂解充分后，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，吸上清液，根據實驗需要取適量蛋白樣本，再加入一定比例的5×蛋白上樣緩沖液，漩渦振蕩，沸水煮5～10 min，進行蛋白定量。實驗時，取20 μg的總蛋白加入到質量分數10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進行垂直凝膠電泳，電轉移至聚偏二氟乙烯膜，室溫封閉洗膜后加ChAT和NOS一抗、二抗處理，ECL化學發光試劑盒曝光顯影，以GAPDH為對照。用凝膠成像系統及Image J v1.42圖像分析軟件進行灰度分析，以目的蛋白與對照蛋白條帶灰度比值表示目的蛋白表達量。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 19.0統計軟件對各項指標進行統計，各組間比較用單因素方差分析，實驗數據用fs表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 黃酒對大鼠離體小腸運動的影響

表1 黃酒對大鼠離體小腸收縮性的影響（n＝5）Table1 Effect of CRW on the contractility of the isolated small intestine (n= 5)

圖1 黃酒對大鼠離體小腸收縮活動的影響Fig.1 Effect of CRW on contractile activity of the isolated small intestine

由表1和圖1A可見，低劑量的黃酒能降低大鼠離體小腸的收縮幅度和收縮頻率，但與處理前相比較，無顯著性差異。中劑量的黃酒處理后，小腸的收縮幅度明顯降低，抑制率為58%，但對小腸的收縮頻率無明顯影響（表1、圖1B）；而高劑量的黃酒處理完全抑制了大鼠離體小腸的收縮，抑制率為100%（表1、圖1C），這些結果暗示黃酒能明顯抑制大鼠離體小腸收縮。

2.2 乙醇對大鼠離體小腸收縮的影響

表2 乙醇對大鼠離體小腸收縮性的影響（n＝5）Table2 Effect of alcohol on contractility of the isolated rat small intestine (n= 5)

圖2 乙醇對大鼠離體小腸收縮活動的影響Fig.2 Effect of alcohol on contractile activity of the isolated small intestine

由表2和圖2A、B可見，低和中劑量的乙醇雖能降低離體小腸的收縮幅度和收縮頻率，但與處理前相比較，無顯著性差異。高劑量的乙醇處理后，小腸的收縮幅度明顯降低，抑制率為47.5%，但對小腸的收縮頻率無明顯影響（表2、圖2C）。暗示黃酒中的乙醇可能參與了對離體小腸收縮幅度的抑制作用。

2.3 去多酚黃酒對大鼠離體小腸收縮的影響

表3 去多酚黃酒對大鼠離體小腸收縮性的影響（n＝5）Table3 Effect of CRW without polyphenols on the contractility of the isolated rat small intestine (n= 5)

圖3 去多酚黃酒對大鼠離體小腸收縮活動的影響Fig.3 Effect of CRW without polyphenols on the contractile activity of the isolated small intestine

由表3、圖3A可見，低劑量的去多酚黃酒能降低離體小腸的收縮幅度和收縮頻率，但與處理前相比較無明顯差異。中、高劑量的黃酒處理后，小腸的收縮幅度明顯降低，抑制率分別為46.00%和56.10%。高劑量的去多酚黃酒能顯著降低小腸的收縮頻率和幅度（表3、圖3C），而中劑量的去多酚黃酒對小腸收縮頻率無明顯影響（表3、圖3B）。結果表明去除黃酒中的多酚后，黃酒仍能明顯抑制小腸的收縮幅度，但抑制作用降低。

2.4 黃酒對大鼠離體小腸肌間神經叢內ChA T蛋白表達的影響

ChAT為膽堿能神經元釋放的乙酰膽堿神經遞質的標志酶。為了檢測黃酒處理后對腸肌間神經叢膽堿能神經元活性的影響，本研究用全層腸道肌間神經叢免疫組化和Western blot技術檢測了ChAT蛋白的變化。

圖4 黃酒對大鼠離體小腸肌間神經叢膽堿能神經元的影響Fig.4 Effect of CRW on cholinergic neurons of myenteric nerve plexus in the isolated small intestine

在腸肌間神經叢中，AChE陽性神經元多聚集在一起構成神經節，神經元胞漿為淡黃色（圖4A1～A4）。與對照組相比較，黃酒處理后，小腸肌間神經叢ChAT陽性神經元數量顯著減少（圖4B）。為了進一步確定黃酒對ChAT蛋白表達的影響，采用Western blot技術檢測了ChAT蛋白表達量的變化，與免疫組化的結果一致，黃酒處理后，與對照組比較，小腸肌間神經叢ChAT蛋白的表達明顯降低（圖4C、D）。

2.5 黃酒對大鼠離體小腸肌間神經叢內NOS蛋白表達的影響

圖5 黃酒對大鼠離體小腸肌間神經叢一氧化氮神經元的影響Fig.5 Effect of CRW on nitric oxide neurons of myenteric nerve plexus in the isolated small intestine

NOS為神經遞質一氧化氮的標志酶。在腸肌間神經叢中，免疫組織化學染色顯示大鼠腸肌間NOS陽性神經元大小不一，胞質染色呈強度不等的棕黃色（圖5A1～A4）。與對照組相比較，黃酒處理后，小腸肌間神經叢NOS陽性神經元數量極顯著增加（圖5B）。為了進一步確定黃酒對NOS蛋白表達的影響，采用Western blot技術檢測了NOS蛋白量的變化，與免疫組化的結果一致，黃酒處理后，與對照組比較，小腸肌間神經叢NOS蛋白的表達明顯升高（圖5C、D）。

3 討 論

黃酒營養成分豐富，而黃酒中的γ-氨基丁酸、多酚和無機元素等可能影響心臟和胃腸的生理功能。本研究用記錄大鼠離體小腸平滑肌收縮的方法，觀察了黃酒對大鼠離體小腸的收縮頻率、幅度的影響，結果發現中、高劑量的黃酒能明顯抑制離體小腸的收縮運動。孫暉等報道乙醇可使家兔小腸平滑肌收縮活動的幅度、頻率明顯減小[7]。本課題組前期研究發現石榴皮多酚可以明顯抑制胃的排空，抑制小腸推進運動和大鼠的排便[8-9]。為了進一步探討黃酒對離體小腸的抑制作用是否與黃酒中的乙醇及多酚有關，本研究設計了相同劑量乙醇以及去多酚黃酒處理離體小腸的實驗方案，結果發現高劑量乙醇和去多酚黃酒能明顯抑制離體小腸的運動，但對小腸收縮的抑制率分別為47.50%和56.10%，明顯低于高劑量黃酒對小腸收縮的抑制作用（抑制率為100%）。表明黃酒中的乙醇及多酚類參與黃酒對離體小腸收縮的抑制作用，但黃酒中是否還有其他成分也參與對離體小腸運動的抑制作用，有待進一步研究。腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）等胃腸道疾病常常表現為腹痛或腹部不適、腹瀉等癥狀[10-11]，IBS的產生主要是因為腸道動力異常，腹瀉的產生通常與腸運動功能異常、吸收異常以及分泌異常有關[8]，IBS嚴重影響人們的正常工作、學習和生活，目前尚無完全控制該疾病的有效治療方法[12]。而各種生理刺激（如炎癥、過敏等）和非生理刺激導致的胃動力反應增強一直被認為是IBS癥狀發生的重要病理生理學基礎[13-14]。本課題組前期研究發現石榴皮多酚可以通過抑制束縛-浸水應激導致胃運動加強、應激性胃黏膜損傷減輕和結腸運動加強[8]。本研究發現黃酒可明顯抑制小腸收縮運動，因此黃酒可能通過降低胃腸運動亢進而減弱胃黏膜損傷、腸痙攣和腹痛等癥狀，而對冷刺激等導致的胃腸道功能紊亂起到一定的保護作用。

腸神經系統（enteric nervous system，ENS）是由位于胃腸道壁內的神經元、腸膠質細胞和神經遞質等組成的網狀結構系統，是具有與腦和脊髓類似的整合和處理信息功能機制的神經系統，以就近控制和調節分布于數米長的胃腸道中的平滑肌、黏膜上皮和血管效應系統[15]。離體腸段的壁內神經叢仍然存在，在適宜的條件下，仍可以保持平滑肌的收縮特性和腸壁神經叢的作用[16]。腸壁內有完整的反射通路，各種神經元相互聯系，形成

與腦和脊髓類似的獨立的“神經系統”，胃腸道接受外源和胃腸壁內固有的神經節（叢）調節[17]，ENS異常會導致胃腸功能紊亂[18]。將離體腸段置于模擬大鼠體內環境的溶液中，在一定的時間內仍能保持消化道平滑肌的生理特性[19]。ENS內有許多小分子神經遞質，如乙酰膽堿[20-22]、5-羥色胺[23]、一氧化氮[24]等。支配平滑肌的運動神經元包括興奮性和抑制性運動神經元，興奮性運動神經元可以釋放乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、P物質等興奮性遞質引起胃腸平滑肌的收縮，而抑制性運動神經元可以釋放一氧化氮、血管活性腸肽等抑制性遞質導致平滑肌的舒張，二者之間存在復雜而精細的平衡[25-26]，ACh是腸動力的興奮性神經遞質，能強烈地刺激胃腸收縮和蠕動，ChAT催化膽堿和乙酰輔酶A合成ACh[27]，ChAT被認為是膽堿能神經元的特異性標記物，1986年Furchgott等證實，一氧化氮作為氣體信號分子具有介導引起血管平滑肌松弛的作用，在胃腸道內廣泛分部[28]。本實驗發現黃酒能明顯抑制離體小腸段的收縮，那么，黃酒是否通過調節腸肌間神經叢的運動神經元而影響了小腸平滑肌的收縮運動？通過腸全層鋪片免疫組化和Western blot技術，探究了黃酒對腸道肌間神經叢興奮性遞質和抑制性遞質釋放的影響，結果發現，經不同劑量的黃酒（黃酒體積分數分別為1.5%、3.5%、10.0%）處理后，肌間神經叢中ChAT陽性神經元數量減少，ChAT蛋白表達下降，而肌間神經叢中NOS陽性神經元數量和NOS蛋白表達增強，表明黃酒可能通過抑制興奮性遞質ACh的釋放以及促進抑制性遞質一氧化氮的釋放，而抑制離體小腸段平滑肌的收縮。研究結果進一步明確了黃酒保健養生的功效和機制，為黃酒價值的提升和黃酒的推廣提供了科學依據。