蛹蟲草多糖調節小鼠巨噬細胞RAW264.7免疫活性的分子機制

苗 月，任桂紅，甄 東，趙 飛，宋 慧,2,*

（1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學 教育部食藥用菌工程研究中心，吉林 長春 130118）

免疫調節作用一直是保健食品領域研究的熱點之一。作為免疫細胞的一員，巨噬細胞無論在先天免疫還是在適應性免疫應答中都發揮著重要的作用[1]。眾所周知，巨噬細胞通過分泌生物因子間接抵抗外來的病原體和刺激物，例如炎性介質一氧化氮（nitric oxide，NO）、白介素（interleukin，IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）[2]。然而，巨噬細胞釋放這些生物因子的分子機制仍需不斷地探究，根據先前的報道，巨噬細胞表面存在眾多的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs），例如Toll樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs），中最經典的Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）、甘露糖受體（mannose receptor，MR）和補體受體3（complement receptor 3，CR3）[3-4]，這些PRRs的功能是識別外來病原體，啟動細胞內信號級聯反應[5]。在免疫調節信號通路中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路是最重要和進化保守的機制之一。MAPK途徑激活后會導致不同轉錄因子的激活，激活的轉錄因子對生物因子的基因表達進行調節，從而調節它們的分泌水平[6]。巨噬細胞能夠識別多種外來刺激物，除致病性的病原體外，還有很多調節巨噬細胞免疫活性的天然產物，如多糖、蛋白、苷類化合物等[7]。近年來，關于真菌多糖調節巨噬細胞免疫應答的報道逐漸增加，真菌多糖的免疫調節活性也逐漸受到了廣泛的重視[8]。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種珍貴的食藥用真菌，具有多種生物活性物質，包括蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖和蟲草多肽等。蛹蟲草具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗衰老、免疫調節、降血糖和保肝等作用[9-10]。近年來關于蟲草多糖對小鼠腹腔巨噬細胞的研究日益廣泛，王米等研究發現蛹蟲草多糖（Cordyceps militaris polysaccharides，CMP）能夠促進小鼠腹腔巨噬細胞分泌NO，增強免疫功能[11]；Lee等發現蛹蟲草發酵液多糖刺激小鼠腹腔巨噬細胞，激活TLR2/4，進而活化下游MAPKs/核因子-кB信號通路誘導NO的產生[12]；蛹蟲草菌絲體中分離的多糖具有良好的免疫調節活性，它能夠上調小鼠腹腔巨噬細胞中的NO、活性氧和TNF-α的分泌和細胞吞噬能力[13]。本研究主要針對CMP對小鼠單核巨噬細胞RAW264.7免疫活性的調節機制進行初步研究，以期為蛹蟲草保健食品開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7由東北師范大學生命科學學院饋贈；CMP從蛹蟲草子實體粉末中經水提醇沉法獲得，經除蛋白后用于本實驗。

DMEM高糖培養基 美國Hyclone公司；胎牛血清杭州四季青公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、甘露聚糖 美國Sigma公司；NO檢測試劑盒、MAPK抑制劑（PD98059、SP600125、SB203580） 上海碧云天生物公司；TNF-α、IL-1β酶聯免疫吸附檢測（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢博士德生物公司；VGX-1027 英國Abcam公司；抗體p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK和β-actin美國CST公司。

1.2 儀器與設備

CO2培養箱 美國NUAIRE公司；酶標儀 北京普朗新技術有限公司；倒置顯微鏡 日本Nikon公司；電泳儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 RAW264.7細胞活性和細胞形態檢測

將小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞密度調整為5h105個/mL，接種到96 孔板中，每孔100 μL，設置陰性對照組、陽性對照組和CMP實驗組。陰性對照組僅加入細胞培養基；陽性對照組加入終質量濃度為1 μg/mL的LPS；CMP實驗組加入不同質量濃度的CMP（終質量濃度分別為12.5、25、50、100、200、400 μg/mL）100 μL；各組均與細胞共培養24 h。培養結束后，加入10 μL噻唑藍繼續孵育4 h，棄去培養基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，以單獨加入150 μL二甲基亞砜孔為空白組。使用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔OD值。細胞存活率按式（1）計算。

式中：OD1、OD2、OD3分別為CMP實驗組、陽性對照組、空白組的光密度值。

將RAW264.7細胞密度調整為5h105個/mL，接種到6 孔板中，每孔1 mL，設置陰性對照組、陽性對照組和CMP實驗組。陰性對照組僅加入細胞培養基；陽性對照組加入終質量濃度為1 μg/mL的LPS；CMP實驗組加入不同質量濃度的CMP（終質量濃度分別為25、50、100、200 μg/mL）1 mL；各組均與細胞共培養24 h。培養結束后，使用倒置顯微鏡觀察細胞形態。

1.3.2 RAW264.7細胞吞噬活性測定

RAW264.7細胞的處理方法同1.3.1節，細胞培養結束后，棄去培養基，向每孔加入100 μL質量分數0.075%中性紅溶液繼續培養1 h，棄去中性紅，用磷酸鹽緩沖液洗兩次，向每孔加入150 μL細胞裂解液，以單獨加入150 μL細胞裂解液孔為空白組。使用酶標儀在540 nm波長處檢測各孔OD值。吞噬率按式（2）計算。

式中：OD1、OD2、OD3分別為CMP實驗組、陽性對照組、空白組的光密度值。

1.3.3 RAW264.7細胞分泌NO、TNF-α和IL-1β檢測

RAW264.7細胞的處理方法同1.3.1節，細胞培養結束后，收取細胞培養上清液，使用試劑盒檢測培養上清液中NO、TNF-α和IL-1β的水平。

1.3.4 抑制劑中和實驗

將RAW264.7細胞密度調整為5h105個/mL，接種到96 孔板中，每孔100 μL，設置對照組、CMP單獨處理組、MR和TLR4抑制劑單獨處理組和實驗組。其中，對照組加入100 μL培養基；CMP單獨處理組加入100 μL CMP（終質量濃度為200 μg/mL）；抑制劑單獨處理組加入甘露聚糖（終質量濃度為0.625 mg/mL）或VGX-1027（終質量濃度為0.5 μg/mL）100 μL；實驗組先用抑制劑預處理1 h，棄去培養基，再加入200 μL質量濃度為200 μg/mL的CMP。各組細胞培養24 h后，使用試劑盒檢測培養上清液中NO、TNF-α和IL-1β的水平；細胞吞噬活性的測定方法同1.3.2節。

將RAW264.7細胞密度調整為5h105個/mL，接種到96 孔板中，每孔100 μL，設置對照組、CMP單獨處理組、MAPK抑制劑單獨處理組和實驗組。其中，對照組加入100 μL培養基；CMP單獨處理組加入100 μL CMP（終質量濃度為200 μg/mL）；MAPK抑制劑單獨處理組加入PD98059、SP600125和SB203580（終濃度20 μmol/L）100 μL；實驗組先用抑制劑預處理1 h，棄去培養基，再加入200 μL質量濃度為200 μg/mL的CMP。各組細胞培養24 h后，使用試劑盒檢測培養上清液中NO、TNF-α和IL-1β的水平。

1.3.5 Western blot檢測MAPKs激活

使用不同終質量濃度的CMP（0、25、50、100、200 μg/mL）處理RAW264.7細胞24 h。使用裂解液提取細胞總蛋白。Western blot方法檢測MAPKs各亞基的表達水平，包括ERK1/2、phosphor-ERK1/2、JNK、phosphor-JNK、p38、phosphor-p38。使用β-actin作為內參。

1.4 數據統計分析

數據以平均值±標準差表示。使用Graphpad 6.05軟件進行繪圖。使用SPSS 22軟件處理數據，差異顯著性采用單因素方差分析法分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 CMP對RAW264.7細胞活性的影響

圖 1 CMP對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.1 Effect of CMP on the proliferation of RAW264.7 cells

如圖1所示，與陰性對照組相比，陽性對照組細胞活性明顯增強（P＜0.01），在CMP 12.5～400 μg/mL質量濃度范圍內，RAW264.7細胞活性先升高后降低，當CMP質量濃度為100、200 μg/mL時，細胞相對存活率為120.31%和124.89%，與陰性對照組相比有極顯著差異（P＜0.01），與LPS組相比無明顯差異（P＞0.05）。當CMP質量濃度達到400 μg/mL時，RAW264.7細胞活性有所下降，并且與對照組相比無統計學差異（P＞0.05）。表明25～200 μg/mL質量濃度范圍內的CMP可以增強RAW264.7細胞活性。因此，選擇質量濃度范圍為25～200 μg/mL的CMP進行后續實驗。

2.2 CMP對RAW264.7細胞形態的影響

在顯微鏡下觀察到LPS和CMP處理的細胞發生了形態改變。對照組細胞體積較小，大部分呈圓形，LPS和CMP處理組細胞體積增大，由圓形變成了長梭形，部分細胞長出了偽足，且細胞變化隨CMP質量濃度的升高而逐漸明顯（圖2），200 μg/mL CMP處理組細胞形態與陽性對照組相似。結果表明CMP可以刺激RAW264.7細胞形態由正常狀態變為激活狀態。

圖2 CMP對RAW264.7細胞形態的影響Fig.2 Effect of CMP on RAW264.7 cell morphology

2.3 CMP對RAW264.7吞噬活性的影響

圖3 CMP對RAW264.7細胞吞噬活性的影響Fig.3 Effect of CMP on phagocytosis activity of RAW264.7 cells

如圖3所示，CMP處理組RAW264.7細胞的吞噬活性隨CMP質量濃度的增加而增強，當CMP質量濃度為50、100、200 μg/mL時RAW264.7細胞的相對吞噬率分別為108.28%、115.13%和121.92%，與陰性對照組相比有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），與陽性對照組刺激作用無顯著差異（P＞0.05）。結果證明CMP可以增強RAW 264.7細胞的吞噬活性。

2.4 CMP對RAW264.7細胞分泌NO、TNF-α和IL-1β的影響

圖 4 CMP對RAW264.7細胞分泌NO（A）、TNF-α（B）和IL-1β（C）的影響Fig.4 Effect of CMP on the secretion of NO (A), TNF-α (B) and IL-1β (C) in RAW264.7 cells

檢測CMP是否能促進RAW264.7細胞分泌炎性介質NO和細胞因子TNF-α和IL-1β。結果如圖4所示，與陰性對照組相比，在實驗質量濃度范圍內，CMP均能夠明顯刺激RAW264.7細胞分泌NO和IL-1β，具有劑量依賴性，且差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖4A、C）。各實驗質量濃度的CMP均能夠刺激RAW264.7分泌TNF-α，與對照組相比具有極顯著差異（P＜0.01），與NO和IL-1β結果不同的是，TNF-α的分泌量呈現先升高后下降的趨勢，在CMP為100 μg/mL時達到最高值，約為1 478 pg/mL（圖4B）。

2.5 TLR4和MR抑制劑抑制CMP對RAW264.7的激活作用

圖 5 TLR4和MR抑制劑對CMP刺激RAW264.7細胞產生免疫應答的影響Fig.5 Effects of TLR4 and MR inhibitors on CMP-induced immune response in RAW264.7 cells

為了驗證TLR4和MR受體是否參與CMP對RAW264.7細胞的激活作用，本實驗分別采用TLR4和MR的抑制劑VGX-1027和甘露聚糖預處理RAW264.7細胞。結果如圖5所示，抑制劑單獨處理組NO、TNF-α和IL-1β的分泌量與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）；VGX-1027和甘露聚糖預處理的細胞在CMP刺激后，培養上清液中NO、TNF-α和IL-1β含量降低，與CMP單獨處理組相比有極顯著差異（P＜0.01）（圖5A～C）。結果表明TLR4和MR能夠參與CMP刺激RAW264.7細胞產生免疫反應，TLR4和MR均為RAW264.7細胞上CMP受體。

2.6 CMP激活MAPK信號通路

圖 6 CMP對RAW 264.7細胞MAPK通路激活的影響Fig.6 Effect of CMP on MAPK pathway activation in RAW 264.7 cells

使用Western blot方法檢測MAPK 3 個亞基ERK1/2、JNK和p38磷酸化水平（圖6A）。如圖6B、C所示，p-p38和p-ERK1/2蛋白相對表達量隨CMP的質量濃度增加而增加，與對照組相比，200 μg/mL CMP處理組相對表達量約為4.53和7.77，與對照組相比有極顯著差異（P＜0.01）；JNK的磷酸化水平雖不呈劑量依賴趨勢，但在200 μg/mL時達到了最高水平，約為對照組的5.35 倍，與對照組相比有極顯著差異（P＜0.01）（圖6D）。結果證明CMP能夠激活巨噬細胞RAW264.7中的MAPK信號通路。

2.7 MAPK抑制劑抑制CMP誘導細胞分泌NO、TNF-α和IL-1β

探究CMP激活MAPK通路在RAW264.7發揮免疫調節中的作用，分別使用MAPK的3 個亞基抑制劑，包括p-38抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125和ERK1/2抑制劑PD98059預處理細胞，再與CMP共培養。如圖7所示，3 種抑制劑單獨處理組NO、TNF-α和IL-1β的分泌量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；與CMP單獨處理立組相比，3 種抑制劑均能夠抑制RAW264.7細胞分泌NO、TNF-α和IL-1β，有極顯著差異（P＜0.01），其中，SP600125對NO和IL-1β分泌抑制效果最明顯，SB203580對TNF-α分泌抑制作用最強，PD98059的抑制作用相對于其他兩種抑制劑較弱。以上結果證明MAPK通路參與CMP誘導的RAW264.7細胞部分免疫應答。

圖 7 MAPK抑制劑對CMP誘導RAW264.7分泌NO（A）、TNF-α（B）和IL-1β（C）的影響Fig.7 Effects of MAPK inhibitors on the secretion of NO (A),TNF-α (B) and IL-1β (C) induced by CMP in RAW264.7 cells

3 討 論

巨噬細胞是機體免疫細胞中最重要類型之一。當機體受到病原體的侵害時，活化的巨噬細胞不僅能夠吞噬病原體，還分泌調節免疫反應的細胞信使，如炎性介質NO、PEG2和細胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β[14]。有研究報道，真菌多糖可以誘導巨噬細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子的分泌[15]，增強巨噬細胞的吞噬活性[16]。本研究結果表明，CMP可以促進RAW264.7細胞增殖，增強細胞吞噬能力，顯著增加NO、TNF-α和IL-1β的產生。這表明CMP可以激活正常狀態下的巨噬細胞，在體外具有較強的免疫調節作用。

當巨噬細胞被激活產生免疫反應時，其表面的免疫相關受體首先被激活，繼而引發細胞中一系列緊密的信號級聯反應，各種免疫相關的信號傳導途徑被協同激活，最終做出一系列的免疫應答[17]。機體的先天性免疫系統通常通過PRRs識別病原體和刺激物，研究最普遍的PRRs是TLRs[18-19]。TLR4是最重要的TLRs之一，主要存在于巨噬細胞，單核細胞，中性粒細胞和樹突狀細胞[20]。最近有研究發現TLR4是一種重要的真菌多糖受體[21]。真菌多糖具有多種生物學活性，免疫調節是其最重要的活性之一。但由于真菌多糖分子質量較高，不能穿透細胞，所以多糖調節免疫活性的第一步是與細胞受體結合[22-23]。據報道，靈芝多糖[24]，豬苓多糖[25]可以與巨噬細胞表面TLR4發生結合。根據這些報道，本實驗研究TLR4是否為CMP的受體。本研究中，TLR4受體抑制劑VGX-1027能顯著阻斷CMP誘導的NO、TNF-α和IL-1β的分泌，從而抑制CMP刺激的巨噬細胞免疫應答。說明TLR4為CMP的受體之一，并且TLR4參與細胞因子產生的信號途徑。本研究還發現，TLR4抑制劑不能完全抑制TNF-α、IL-1β和NO的產生，這說明巨噬細胞上存在其他可識別CMP的受體，所以本研究進行了相同的實驗來檢測其他膜受體。

近年來的研究表明，巨噬細胞表面PRRs MR也與免疫密切相關。巨噬細胞上MR的表達受病原體及其產物、皮質類固醇、前列腺素和細胞因子調控[26]。Wang Changlu等從杏鮑菇分離得到的多糖含有甘露糖組分，這在一定程度上解釋了MR在杏鮑菇多糖刺激巨噬細胞產生細胞因子中的重要作用[27]。Li Wenjuan等用黑靈芝多糖對巨噬細胞進行刺激，實驗結果表明，MR與巨噬細胞的吞噬能力增強和TNF-α和IL-1β的分泌增加有關[26]。因此推測巨噬細胞上CMP的許多受體中存在MR。本實驗采用了與TLR4相同的檢測方法，最終證明MR同樣能夠參與CMP對巨噬細胞的免疫調節。

然而，受體的激活只是免疫應答的第一步。在細胞中，有許多下游信號轉導通路負責調節細胞功能，包括細胞增殖、基因表達、免疫應答和細胞凋亡[28]。TLRs下游信號通路主要包括調節細胞功能的MAPK，如c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38和細胞外信號調節激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）[29]。Xu Duoduo等從杏鮑菇中提取的多糖EPA-1能夠誘導RAW264.7細胞分泌NO和TNF-α、IL-1和IL-6等細胞因子，并且EPA-1以劑量依賴性方式促進p38，ERK1/2和JNK磷酸化，從而通過MAPK途徑參與巨噬細胞免疫調節過程[30]。竹蓀多糖通過MAPK/NF-kB信號通路調節NO和TNF-α等活性因子的產生[31]。本研究結果顯示，用CMP處理RAW264.7細胞能夠激活MAPK通路，且MAPK通路的激活參與CMP誘導的RAW264.7細胞分泌NO、TNF-α和IL-1β。

總之，CMP表現出較強的免疫調節活性，能夠激活RAW264.7細胞，增強RAW264.7細胞吞噬活性并誘導細胞因子產生。TLR4和MR是RAW264.7細胞膜上的CMP受體，此外，MAPK信號通路也參與CMP誘導RAW264.7細胞分泌NO、TNF-α和IL-1β。因此，本實驗證明了CMP通過TLR4、MR/MAPK信號傳導途徑誘導RAW264.7細胞產生免疫應答，這有助于初步理解CMP活化RAW264.7細胞的分子機制，為蛹蟲草保健品的合理開發和應用提供新的視角。但CMP調節巨噬細胞免疫反應具體的分子機制仍需進一步研究，在巨噬細胞上仍存在其他CMP的受體有待于發現，未來仍需不斷地開拓新思路，將真菌多糖作為免疫佐劑廣泛地應用到保健品的開發和生產中。