貯藏溫度對鮮切胡蘿卜品質及總酚和γ-氨基丁酸含量的影響

朱惠文，湯 靜，金 鵬，鄭永華*

（南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

胡蘿卜（Daucus carota L.）含有豐富的營養(yǎng)成分，尤其是胡蘿卜素的含量很高，具有補肝明目等保健價值[1]。近年來，鮮切果蔬因新鮮方便和健康衛(wèi)生等特點廣受消費者青睞，需求量日益增長[2-3]。研究表明，鮮切加工造成的機械損傷會誘導果蔬產生多酚和黃酮等次生代謝產物以抵御損傷、保護組織，且溫度越高，這種損傷防御反應越強，產生的酚類物質等次生代謝產物越多[4-6]。在鮮切胡蘿卜研究方面，與18～20 ℃室溫貯藏相比，4～5 ℃低溫貯藏能顯著抑制鮮切胡蘿卜的呼吸作用等生理生化變化、降低抗壞血酸等營養(yǎng)成分的損失、減緩鮮切胡蘿卜的褐變，從而較好地保持其品質[7-10]。這些結果表明，低溫貯藏可延緩鮮切果蔬品質劣變、延長貨架期，而較高貯藏溫度可促進鮮切果蔬中酚類物質的積累，提高抗氧化活性。此外，植物處于逆境（包括缺氧、冷害、熱刺激和機械刺激等）條件下體內會合成和積累γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），以提高植物體對這些逆境脅迫的抗性。GABA是一種廣泛存在于動物、植物和微生物中的非蛋白質氨基酸，它能起到改善人類睡眠和提高免疫力等作用[11]。目前，國內外關于GABA在植物體內合成積累的報道大部分以發(fā)芽種子[12]、植物葉片[13]和植株幼苗[14]等為研究對象，而有關鮮切果蔬中GABA合成和含量變化還鮮有報道。

本實驗在研究不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜主要品質指標影響的基礎上，進一步探討貯藏溫度對鮮切胡蘿卜總酚、GABA含量及其合成關鍵酶活力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的影響，以期為鮮切胡蘿卜的保鮮和科學食用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試胡蘿卜品種為‘黑田五寸人參’，購于南京眾彩農副產品物流市場。采購后立即運回實驗室，挑選完全成熟、大小均一、表面無機械損傷、無病蟲害的新鮮胡蘿卜作為實驗材料。

β-胡蘿卜素、福林酚、碳酸鈉、GABA 南京杰汶達試劑器材有限公司；三氯乙酸、鄰菲啰琳、三氯化鐵國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸、DPPH、L-苯丙氨酸 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

MIR-253恒溫培養(yǎng)箱 上海恒逸實業(yè)有限公司；HP-2132型色差儀 深圳漢譜光彩科技有限公司；GL-20G-H型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；pH610臺式酸度計 北京桑翌實驗儀器研究所；FA1104電子天平 上海精密科學儀器有限公司；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司；UV-1600型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

挑選好的胡蘿卜用200 μL/L次氯酸鈉溶液浸泡消毒2 min，清洗后平鋪于實驗操作臺上瀝干水分。自然晾干后用鋒利的不銹鋼菜刀去皮，借助切菜機對胡蘿卜進行切絲處理（10 cmh0.5 cmh0.2 cm），然后裝入保鮮盒（20 cmh12 cmh8 cm）中，每盒約120 g，在貯藏溫度4、10 ℃和20 ℃條件下分別貯藏6、4、2 d，相對濕度90%～95%。每個貯藏溫度15 盒樣品，貯藏期間每個溫度隨機取3 盒樣品測定各項指標。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 菌落總數測定

菌落總數參照GB 4789.2ü2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》測定。

1.3.2.2 質量損失率測定

質量損失率的測定采用稱質量法，以貯藏期間失去的水分質量占初始質量的比例表示質量損失率。

1.3.2.3 顏色測定

顏色的測定參照歐燕等[15]的方法。將胡蘿卜絲不留空隙地平鋪于桌面上，采用HP-2132型色差儀隨機選取若干點測定樣品的顏色參數，得到CIE-Lab表白色系中的L值（明度，變化范圍從0～100，0代表黑色，100代表白色）、a值（紅度，正值代表紅色，負值代表綠色）、b值（黃度，正值代表黃色，負值代表藍色）。每次測定10 個點。白度的計算公式如下。

1.3.2.4 總胡蘿卜素和抗壞血酸含量測定

總胡蘿卜素含量的測定參照許輝等[16]的方法并稍作改動：稱取3.0 g胡蘿卜樣品加入25 mL石油醚-丙酮（1∶0.5，V/V）混合液研磨提取。然后將提取液過濾至裝有10 mL蒸餾水的分液漏斗中，蓋塞振搖1 min進行萃取，靜置2 min，待水相與石油醚相明顯分層后，緩緩去除水相，將萃取的石油醚相倒入25 mL棕色容量瓶中，再向分液漏斗中倒入適量的石油醚進行潤洗，重復2～3 次，一起并入容量瓶中，即為最終的提取液。測定其在451 nm波長處的吸光度，單位為mg/100 g，結果以鮮質量計。

抗壞血酸含量的測定采用曹建康等[17]的方法（鄰菲啰琳比色法），單位為mg/100 g，每次取樣3.0 g，結果以鮮質量計。

1.3.2.5 苯丙氨酸解氨酶活力、總酚含量及DPPH自由基清除能力測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活力的測定參照曹建康等[17]的方法，以每小時每克鮮胡蘿卜酶促反應體系在290 nm波長處吸光度增加0.01為1 個PAL活力單位（U），單位為U/g。總酚含量的測定參照Slinkard等[18]的方法，以每千克鮮胡蘿卜中的沒食子酸質量來表示，單位為mg/kg。DPPH自由基清除能力的測定參照Soengas等[19]的方法。以上指標測定時每次取樣3.0 g。

1.3.2.6 GABA含量和谷氨酸脫羧酶活力測定

GABA含量的測定參照趙大偉等[20]的方法，并略作修改。取3.0 g胡蘿卜樣品，加入5 mL磷酸緩沖液（pH 7.8）低溫研磨后離心。取1 mL上清液依次加入0.6 mL 0.2 mol/L pH 9.0硼酸鹽緩沖液、2 mL 6 g/100 mL苯酚溶液、1 mL 5.5 g/100 mL次氯酸鈉溶液，搖勻后放入沸水浴中加熱5 min，再放入冰浴中冷卻至室溫，直到顏色變成藍綠色，在645 nm波長處測定溶液的吸光度。GABA含量的單位為mg/100 g，結果以鮮質量計。

谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活力的測定參照楊勝遠等[21]的方法，并略作修改。稱3.0 g胡蘿卜樣品，加入5 mL 0.2 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.0，含0.1 mmol/L磷酸吡哆醛（pyridoxal5-phosphatemonohydrate，PLP）、1 mmol/L二硫蘇糖醇）低溫研磨離心。取0.4 mL粗酶液，依次加入0.1 mL pH 5.0磷酸緩沖液、0.2 mL 0.2 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.2 mL 40 mmol/L L-谷氨酸溶液（pH 5.0，含0.02 mmol/L PLP），搖勻后于40 ℃水浴1 h。隨后加入0.05 mL無水乙醇（－18 ℃存放）終止反應。再加入0.05 mL 1 mol/L Na2CO3溶液，測定產生的GABA含量。以每1 h生成1 μg GABA為一個酶活力單位（U），單位為U/g，結果以鮮質量計。

1.4 數據統(tǒng)計分析

指標均取3 個平行樣，重復測定3 次。數據采用Excel 2010軟件處理，并采用SAS 8.1軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜菌落總數、質量損失率、總胡蘿卜素含量和抗壞血酸含量的影響

菌落總數是用來評價鮮切果蔬安全性及貨架期的重要指標。據報道，鮮切果蔬的菌落總數通常不超過106CFU/g[22-23]。圖1A表明，鮮切胡蘿卜在貯藏期間菌落總數持續(xù)增長，且隨著溫度的升高而增加。與10、20 ℃相比，4 ℃下鮮切胡蘿卜菌落總數增長最為平緩，且貯藏到4 d時菌落總數小于105CFU/g，而20 ℃條件下貯藏1 d，菌落總數就已達到105CFU/g。在4、10、20 ℃下分別貯藏6、4、2 d，鮮切胡蘿卜的菌落總數均未超過106CFU/g，仍在可食用范圍內。

圖1 不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜菌落總數（A）、質量損失率（B）和總胡蘿卜素含量（C）、抗壞血酸含量（D）的影響Fig.1 Effects of different storage temperatures on total bacterial count (A), mass loss rate (B), total carotene (C) and ascorbic acid (D)content of fresh-cut carrot

質量損失率是衡量鮮切胡蘿卜貯藏期間失水和新鮮程度的重要指標。圖1B表明，3 個貯藏溫度下的鮮切胡蘿卜質量損失率均呈上升趨勢，其中，20 ℃條件下鮮切胡蘿卜的質量損失率上升最快，10 ℃的次之，4 ℃貯藏的質量損失率增加最為緩慢。在本研究中，由于鮮切胡蘿卜貯藏條件的相對濕度均為90%～95%，因此在4、10、20 ℃下貯藏6、4、2 d后的質量損失率都低于1%，都保持了新鮮品質。

胡蘿卜素是胡蘿卜中含量最高且營養(yǎng)價值最高的物質。然而，胡蘿卜經過去皮、切分后表面韌皮部暴露在空氣中接觸O2和光，引起胡蘿卜素的自動氧化，導致產品中的總胡蘿卜素含量減少[24]。圖1C表明，新鮮胡蘿卜的總胡蘿卜素含量為5.91 mg/100 g，貯藏期間鮮切胡蘿卜中總胡蘿卜素含量逐漸降低。在20 ℃貯藏2 d后，鮮切胡蘿卜的總胡蘿卜素含量就已經下降到初始含量的45.9%。10 ℃條件下的鮮切胡蘿卜貯藏至2 d時為初始水平的72.4%。4 ℃條件下，鮮切胡蘿卜的總胡蘿卜素含量在貯藏期內一直緩慢下降，并始終高于另外兩個溫度貯藏組，由此說明低溫能延緩鮮切胡蘿卜中胡蘿卜素的降解，更好地保持營養(yǎng)成分。

圖1D表明，鮮切胡蘿卜中抗壞血酸含量在3 個溫度貯藏過程中均逐漸降低，并且溫度越高，下降速度越快。在4、10 ℃和20 ℃貯藏6、4 d和2 d后，鮮切胡蘿卜的抗壞血酸含量分別為初始含量的82.9%、72.7%和62.9%，其中4 ℃下鮮切胡蘿卜中抗壞血酸損失最少，10 ℃下次之，20 ℃下?lián)p失最多，說明低溫貯藏下的鮮切胡蘿卜中抗壞血酸含量更高。

2.2 不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜顏色的影響

圖2 不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜L值（A）、a值（B）、b值（C）和白度（D）的影響Fig.2 Effects of different storage temperatures on L (A), a (B) and b values (C) and whiteness (D) of fresh-cut carrot

胡蘿卜在去皮切分后易發(fā)生脫水，在損傷表面生成一種白色物質——木質素，即發(fā)生白變，使外觀品質變差[25-26]。在本研究中，采用色差L、a、b值和白度來反映鮮切胡蘿卜表面的顏色變化。L值越大，表面亮度越高；a值越小，紅色褪去越多；b值越小，黃色褪去越多；由此導致白度也越大，這些均可反映鮮切胡蘿卜在貯藏期間的白變情況。由圖2可知，鮮切胡蘿卜在貯藏期間其L值和白度持續(xù)上升，而a值和b值持續(xù)下降。貯藏溫度越高，L值和白度上升越快，a值和b值的下降也越快，說明低溫可抑制鮮切胡蘿卜的脫水白變，有利于保持外觀品質。在本研究中，鮮切胡蘿卜在4、10、20 ℃下貯藏6、4、2 d后都保持了良好的外觀品質。

2.3 不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜PAL活力、總酚含量及DPPH自由基清除能力的影響

從圖3A可以看出，鮮切胡蘿卜在貯藏前期PAL活力快速上升，且溫度越高，PAL活力上升得越快。20 ℃條件下，鮮切胡蘿卜的PAL活力在切割后幾個小時內急劇上升，并在24 h達到峰值，隨后又以較快速度下降；與20 ℃相比，4 ℃和10 ℃條件下鮮切胡蘿卜的PAL活力上升的幅度相對較小，4 ℃下持續(xù)緩慢上升，10 ℃下達到峰值的時間延遲至2 d。

由圖3B可知，3 個溫度下鮮切胡蘿卜的總酚含量均呈持續(xù)上升趨勢，其中，20 ℃組上升速率最快，10 ℃組次之，4 ℃組上升最慢；至貯藏結束時，4、10 ℃和20 ℃條件下貯藏的鮮切胡蘿卜總酚含量分別為初始含量的2.18、4.08 倍和6.64 倍，說明較高溫度貯藏可促進酚類物質的合成積累。

DPPH自由基清除能力是衡量果蔬抗氧化能力的重要指標。如圖3C所示，3 種溫度下，鮮切胡蘿卜DPPH自由基清除能力在貯藏期間變化趨勢與總酚含量基本相同，均總體呈升高趨勢。貯藏結束時，4、10 ℃和20 ℃下鮮切胡蘿卜的DPPH自由基清除能力分別比貯藏初期高128.1%、140.2%、140.8%，說明較高溫度貯藏可提高鮮切胡蘿卜的抗氧化活性。

圖3 不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜PAL活力（A）、總酚含量（B）及DPPH自由基清除能力（C）的影響Fig.3 Effects of different storage temperatures on PAL activity (A),total phenolic content (B) and DPPH radical scavenging activity (C) of fresh-cut carrot

2.4 不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜GABA含量和GAD活力的影響

高等植物中GAD催化谷氨酸生成GABA，而GAD活力受溫度、pH值和鈣調蛋白等調控[11]。從圖4A可以看出，在4、10 ℃和20 ℃條件下，鮮切胡蘿卜中GABA含量隨著貯藏時間的延長不斷增加，其中20 ℃下鮮切胡蘿卜GABA含量增加最快，10 ℃次之，4 ℃下增加最慢，直至貯藏結束，20、10、4 ℃貯藏組分別比初始值增加了56.1%、33.7%和34.4%。

由圖4B可知，3 種不同溫度下鮮切胡蘿卜GAD活力在貯藏期間整體上呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。20 ℃下，胡蘿卜鮮切后GAD活力快速上升，并在1 d時達到最大值，隨后呈緩慢下降趨勢；10 ℃下，鮮切胡蘿卜的GAD活力也在1 d達到峰值，1～2 d保持穩(wěn)定，2 d后緩慢下降；4 ℃下，鮮切蘿卜GAD活力到達峰值時間延長至2 d，2 d后以較快速度降低后又緩慢上升。

上述結果表明，在能保證鮮切胡蘿卜安全性和品質的前提下，較高溫度貯藏鮮切胡蘿卜可提高GABA合成關鍵酶GAD的活力，從而促進鮮切胡蘿卜中GABA的合成與積累，提高鮮切胡蘿卜的營養(yǎng)價值。在貯藏后期出現(xiàn)GAD活力下降但GABA含量仍增加的現(xiàn)象，這可能是多胺降解的結果，因為多胺的降解是GABA合成的又一條途徑，逆境條件中植物體內的多胺經過一系列復雜反應也可以生成GABA[27]。

圖4 不同貯藏溫度對鮮切胡蘿卜GABA含量（A）和GAD活力（B）的影響Fig.4 Effects of different storage temperatures on GABA content (A)and GAD activity (B) of fresh-cut carrot

3 討 論

果蔬經過鮮切后，表皮受損、細胞結構遭到破壞，汁液外流導致營養(yǎng)成分流失，并容易遭受微生物侵染而發(fā)生腐敗變質。貯藏溫度是影響鮮切果蔬品質和貯藏期的關鍵因素[28]。適宜的低溫條件可有效減慢鮮切果蔬的新陳代謝，抑制各類氧化酶活性，延緩果蔬組織褐變與衰老，同時低溫能有效抑制微生物活動，延長鮮切果蔬的貯藏期[29]。田欣等[30]發(fā)現(xiàn)，0 ℃低溫能顯著減緩鮮切胡蘿卜貯藏期內的失水、褐變和腐爛。任麗芳等[7]研究發(fā)現(xiàn)，與8 ℃和20 ℃相比，4 ℃貯藏條件顯著抑制了鮮切胡蘿卜的質量損失率和呼吸強度上升，減少丙二醛產生并降低VC的損失率，延緩其衰老進程，使其較大程度地維持了機體原有性狀和品質。馬躍等[8]的實驗表明，4 ℃低溫條件能更好地保持鮮切胡蘿卜的品質。本實驗再次證實了以上結論，與10 ℃和20 ℃貯藏相比，4 ℃低溫貯藏可顯著抑制鮮切胡蘿卜菌落總數、質量損失率、白度的增加及總胡蘿卜素和抗壞血酸含量的下降，使營養(yǎng)成分和品質得到較好的保持。

果蔬在受到機械損傷時，會啟動自身應答機制來抵御損傷脅迫，包括信號分子的生成和識別、防御相關基因的表達以及生成新的代謝產物來修復受傷組織[31-32]。鮮切西蘭花在貯藏中總酚含量持續(xù)上升，貯藏6 d后總酚含量比對照組上升了20%[33]。李靜等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，鮮切萵苣在貯藏期間PAL活力和總酚含量都呈上升趨勢，并在24 h后達到峰值。本研究發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜經過鮮切后PAL活力在貯藏前期快速上升，同時總酚含量持續(xù)增加，且貯藏溫度越高，PAL活力上升越快，總酚含量積累越多。這些結果表明，較高的貯藏溫度在機械損傷的基礎上進一步促進了鮮切胡蘿卜PAL活力的上升，加速了酚類物質的合成與積累，這與韓聰等[6]在香菜中的實驗結果一致，說明在能保證鮮切胡蘿卜安全性和品質的前提下，溫度越高，胡蘿卜在切割損傷后的愈傷能力越強，產生的次級代謝產物越多。本實驗用DPPH自由基清除能力來衡量鮮切胡蘿卜的抗氧化能力，結果發(fā)現(xiàn)，鮮切胡蘿卜的DPPH自由基清除能力總體變化趨勢與總酚含量變化趨勢一致，這是因為鮮切胡蘿卜的抗氧化能力與其總酚含量有關，這與有關鮮切紅心蘿卜[35]、火龍果[36]和菠蘿[37]等的報道結果一致。

GABA具有改善人類睡眠和提高免疫力等多種生理功能。植物體中，GABA合成主要是通過GAD催化谷氨酸生成，GAD活力提高是GABA含量增加的主導因素。正常情況下，植物體中GABA的含量約為0.03～2.00 μmol/g，而當植物受到缺氧、冷害和熱刺激及機械損傷等逆境條件時，GABA含量可增加幾倍至幾十倍[11]。Liao Jieren等[13]研究發(fā)現(xiàn)，茶葉的葉片浸水后置于真空缺氧環(huán)境中會產生大量的GABA，貯藏至11 h時達到峰值，比對照組（未處理的新鮮茶葉）增加了20 倍；并且GAD活力顯著提高，在3 h時達到最大。何娜等[38]發(fā)現(xiàn)，結球甘藍葉片經鮮切處理后GABA含量增加，且切分損傷強度越大，GABA含量增加越多。豇豆細胞在熱刺激下GABA含量也迅速增加，24 h后達到最高值，GABA含量是原來的18 倍[39]。然而，關于不同貯藏溫度對于鮮切果蔬GABA含量和GAD活力影響的研究報告還很少。本研究結果顯示，鮮切胡蘿卜GAD活力和GABA含量在貯藏期間前期均呈現(xiàn)上升趨勢，且貯藏溫度越高，GAD活力越高，GABA含量增加越多，說明在鮮切胡蘿卜安全性和品質能得到保證的前提下，較高溫度下短期貯藏在切割損傷的基礎上進一步促進了鮮切胡蘿卜GAD活力，從而誘導鮮切胡蘿卜GABA的合成積累，提高了鮮切胡蘿卜的營養(yǎng)價值。

綜上所述，與10 ℃和20 ℃貯藏相比，4 ℃低溫貯藏可顯著抑制鮮切胡蘿卜菌落總數、質量損失率、白度的上升及總胡蘿卜素、抗壞血酸含量的下降，保持鮮切胡蘿卜的品質，延長貯藏期。而在20 ℃較高溫度下短期貯藏，在保證鮮切胡蘿卜安全性和品質的前提下，還可提高鮮切胡蘿卜PAL和GAD活力，促進酚類物質和GABA的合成積累，從而提高鮮切胡蘿卜的抗氧化活性和營養(yǎng)價值。