酚酸增強(qiáng)楊梅清汁貯藏期間色澤穩(wěn)定性

樓樂燕，陳虹吉，尹 培，沈 清，陳健初*，葉興乾，劉東紅

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品研究院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心，浙江 杭州 310058）

楊梅（Myrica rubra Sieb. et Zucc.）為楊梅科（Myricaceae）楊梅屬（Myrica）常綠喬木植物，是我國亞熱帶特有的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)樹種和生態(tài)樹種[1]。楊梅果實的可食率達(dá)到90%以上，除了富含糖、有機(jī)酸和多種維生素等營養(yǎng)成分外，還含有花色苷和類黃酮等活性成分，有益人體健康[2]。然而楊梅成熟期集中、采后呼吸旺盛，導(dǎo)致楊梅不易于保鮮，故將其加工成楊梅制品成為一種緩解楊梅銷售壓力、減少楊梅采后損失、提高楊梅產(chǎn)品附加值的重要手段。其中楊梅汁作為一種果蔬汁，不僅色澤艷麗、酸甜可口，而且能保留花青素、抗壞血酸等生物活性化合物，具有一定的保健功能，市場發(fā)展?jié)摿^大。色澤是楊梅汁感官品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。楊梅汁的主要呈色物質(zhì)為花色苷，是一類由花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而形成的類黃酮物質(zhì)[3]。但是花色苷極不穩(wěn)定，易受pH值、溫度、光照等的影響而降解[4]，生成無色的查耳酮或其同分異構(gòu)體α-二酮[5]，從而導(dǎo)致楊梅汁在加工貯藏過程中發(fā)生褐變[6]，失去誘人色澤，影響產(chǎn)品外觀，極大地限制了產(chǎn)品的銷售流通。Fang Zhongxiang等[7]研究加工和貯藏條件對楊梅汁色澤品質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn)，巴氏殺菌和漂燙處理后的果汁總酚、花色苷含量均比SO2處理組有明顯的升高，Yu Yong等[8]研究發(fā)現(xiàn)高壓處理后的楊梅汁相比對照組花色苷、抗壞血酸及色澤穩(wěn)定性都顯著增強(qiáng)。郎婭等[9]以花色苷含量和澄清效果為主要評價指標(biāo)比較不同澄清劑對楊梅汁的澄清效果，發(fā)現(xiàn)硅藻土對花色苷損失影響最小，且能達(dá)到較好的澄清效果。故關(guān)于如何加深楊梅汁顏色及提高其花色苷的穩(wěn)定性成為近年的研究熱點。

分子輔色技術(shù)源于植物花色苷在自然生化條件下的穩(wěn)定呈色機(jī)制，是改善并穩(wěn)定含花色苷食品顏色的一種安全且行之有效的方法[10]。常用于花色苷輔色的輔色素主要有類黃酮、有機(jī)酸、氨基酸、生物堿、金屬離子等[11]，其作用方式主要包括分子內(nèi)輔色、分子間輔色、自身交聯(lián)和金屬絡(luò)合4 種[10]。為探究花色苷與輔色素之間的輔色效應(yīng)，許多研究者在模擬花色苷溶液方面做了相應(yīng)的研究[12-13]。Zhang Bo等[14]在紅葡萄酒模擬溶液中添加羥基苯甲酸類化合物，發(fā)現(xiàn)花色苷表現(xiàn)出紅移和增色效應(yīng)。Malaj等[15]研究了對香豆酸、香草酸及丁香酸對錦葵色素-3-葡萄糖苷的輔色作用時，發(fā)現(xiàn)這3 種有機(jī)酸均能顯著增強(qiáng)花色苷溶液的色澤強(qiáng)度及穩(wěn)定性。劉松等[16]發(fā)現(xiàn)單寧酸對黑米色素、紅樹莓色素和甘藍(lán)紅色素3 種物質(zhì)中提取的天然色素都有輔色效果。

由于楊梅的產(chǎn)地主要集中在中國江浙一帶且楊梅成熟期短、保鮮技術(shù)落后，目前國內(nèi)外對楊梅清汁中花色苷的輔色研究較少，僅有的研究也停留在花色苷模擬溶液[17]，沒有考慮輔色劑對楊梅清汁貯藏期間的色澤穩(wěn)定性及品質(zhì)的影響。酚酸作為常用的輔色劑，且具有較強(qiáng)的生物活性，常見的苯甲酸型酚酸有丁香酸、香草酸等，常見的肉桂酸型酚酸有芥子酸、阿魏酸、對香豆酸等，還有不屬于以上兩種類型的縮合酸如綠原酸、單寧酸等[18]。故本實驗選取幾種具有代表性的酚酸對楊梅清汁進(jìn)行輔色研究，通過加速貨架期實驗，結(jié)合花色苷保留率、CIELab色彩空間及楊梅清汁的一些基礎(chǔ)理化指標(biāo)來對輔色作用進(jìn)行評價，以便為生產(chǎn)色澤更加穩(wěn)定的楊梅清汁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊梅（荸薺種）采購自浙江省寧波慈溪市，立即冷藏至－18 ℃冰箱備用。

綠原酸（純度95%）、芥子酸（純度98%）、丁香酸、阿魏酸（純度99%）、單寧酸、果膠酶（30 000 U/g）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；中性蛋白酶（20萬 U/g） 江蘇銳陽生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-10數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋 金壇市科杰儀器廠；UV-2550紫外分光光度計、PB-10型pH計 日本島津公司；Color Flex EZ全自動色差計 美國Hunt Lab顏色管理公司。

1.3 方法

1.3.1 楊梅清汁的制備

楊梅粗汁加工流程：楊梅解凍→打漿→4 層紗布粗濾→蛋白酶酶解、滅酶、離心過濾→果膠酶酶解、滅酶，離心過濾→楊梅粗汁，－18 ℃冰箱冷藏備用。

將楊梅粗汁解凍，用0.22 μm孔徑的醋酸纖維膜過濾，得到透光率較高的楊梅清汁，避光放置備用。

1.3.2 添加酚酸進(jìn)行輔色處理

參考Zhang Bo等[19]的方法結(jié)合實際成本問題，按花色苷與輔色劑物質(zhì)的量1∶20的比例在楊梅清汁中添加5 種不同的酚酸：單寧酸、阿魏酸、芥子酸、綠原酸、丁香酸，酚酸先在極少量的無水乙醇中溶解。對照組為不添加輔色劑的楊梅清汁。混合均勻后分裝至玻璃小瓶中，于65 ℃水浴30 min滅菌，滅菌后迅速冷卻。

1.3.3 加速貨架期實驗

將對照組和輔色處理的楊梅清汁分別置于4 ℃冰箱及25、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貯藏21 d，每3 d測定各理化指標(biāo)。

1.3.4 指標(biāo)的測定

1.3.4.1 花色苷質(zhì)量濃度的測定

花色苷質(zhì)量濃度的測定采用賈娜等[20]的pH示差方法并稍作修改。取兩個10 mL容量瓶各加入1 mL的楊梅清汁，分別用pH 1.0的緩沖液（V（0.2 mol/L KCl）∶V（0.2 mol/L HCl）＝25∶67）和pH 4.5緩沖液（V（1 mol/L NaCOOH）∶V（1 mol/L HCl）∶V（H2O）＝10∶6∶9）定容，在冰箱中避光靜置2 h。分別在520 nm和700 nm波長處測吸光度A，花色苷質(zhì)量濃度按式（1）計算，結(jié)果以每升溶液中所含矢車菊3-葡萄糖苷質(zhì)量計。

式中：A＝（A520nm－A700nm）pH1.0－（A520nm－A700nm）pH4.5，

M為矢車菊3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（449.2 g/mol）；DF為稀釋倍數(shù)（10）；ε為矢車菊3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（26 900 L/（molgcm））；1為比色皿的光程，單位為cm。

花色苷保留率按式（2）進(jìn)行計算。

式中：ρ0、ρt分別為貯藏0、t d時的花色苷質(zhì)量濃度/（mg/L）；t為貯藏時間/d。

1.3.4.2 楊梅清汁花色苷降解動力學(xué)

花色苷降解動力學(xué)的計算參考張麗霞[21]的方法并稍作修改，根據(jù)花色苷的殘留率，按公式（3）計算一級動力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)（k）。

花色苷降解的半衰期（T1/2/d）按式（4）計算。

式中：k為一級動力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)/（mg/（mLgd））。

1.3.4.3 色差的測定

采用全自動色差計接測定。于反射模式下測定樣品的L*、a*、b*值，每個樣品設(shè)置3 個組[22]。L*值從100到0表示由白色變?yōu)楹谏琣*值由小到大代表顏色從綠變紅，b*值由小到大代表顏色從藍(lán)變黃。C*值表示色彩的飽和度，具體按式（5）計算；總色差（total color difference，TCD）表示總的顏色變化大小，按式（6）計算。將色差值用Photoshop軟件還原成色塊，作成直觀的顏色圖[23]。

式中：ΔL*、Δa*、Δb*分別表示貯藏t與0 d時L*、a*、b*的差值。

1.3.4.4 透光率的測定

測定前將楊梅清汁搖勻，取3 mL，以蒸餾水為參比溶液，將紫外分光光度計設(shè)置成透光率模式，在720 nm波長處測定透光率。

1.3.4.5 抗氧化活性測定

采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法測定楊梅清汁的抗氧化能力，參考程煥[24]的方法并稍作修改，稱取16 mg DPPH試劑，加無水乙醇定容至500 mL，得到DPPH溶液貯存在棕色試劑瓶中，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

取40 μL楊梅清汁加入4.5 mL的DPPH溶液，振蕩將其充分混合，室溫避光反應(yīng)30 min后取出在517 nm波長處測定吸光度（A1），空白中加入40 μL無水乙醇溶液，測定吸光度（A0），每個樣品重復(fù)測定3 次。DPPH自由基清除率按式（7）進(jìn)行計算。

1.3.4.6 可溶性固形物含量、可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值的測定

可溶性固形物（total soluble solid，TSS）含量采用手持式糖度計進(jìn)行測定，單位為°Brix。

可滴定酸（tiratable acidity，TA）質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用手動滴定法測定，取1 mL楊梅清汁用0.03 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定至終點，TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)根據(jù)公式（8）計算。

式中：c為氧氧化鈉溶液濃度（0.03 moI/L）；V1為滴定消耗氫氧化鈉溶液體積/mL；V為楊梅清汁的體積/mL；K為檸檬酸折算系數(shù)（0.064）。

pH值采用pH計直接測定，用pH值為4.01、6.86和9.81的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液來進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個樣品設(shè)3 個平行，實驗數(shù)據(jù)均采用Excel 2016和SPSS軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）和鄧肯氏（Duncan’s）差異分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚酸輔色對楊梅清汁貯藏期間花色苷穩(wěn)定性的影響

楊梅清汁中花色苷的含量不僅會影響果汁的色澤，更是評價果汁營養(yǎng)價值的一個重要指標(biāo)。圖1顯示了在不同的貯藏溫度條件下，不同酚酸對楊梅清汁花色苷穩(wěn)定性的影響。由圖1可知，相比25 ℃和37 ℃，在4 ℃貯藏溫度下，楊梅清汁花色苷穩(wěn)定性最好，貯藏21 d后，該溫度下除丁香酸輔色組及對照組，其余酚酸輔色后的楊梅清汁花色苷保留率均在90%以上（圖1A）。由圖1B、C可知，25 ℃和37 ℃的貯藏溫度下，楊梅清汁花色苷的破壞加速，輔色作用相比4 ℃有所減弱，推測可能是由于貯藏溫度升高破壞了輔色反應(yīng)形成的非共價鍵[25]。其中25 ℃貯藏條件下，對照組在第12天時花色苷保留率僅為51%，第21天時花色苷保留率降為36.18%，單寧酸和芥子酸輔色組在第21天時花色苷保留率分別為54.16%和54.30%，保留率均達(dá)50%以上，顯著高于對照組（P＜0.05）；而此時阿魏酸、綠原酸和丁香酸輔色組的保留率分別為45.05%、47.04%和43.93%。說明這5 種酚酸均對楊梅清汁產(chǎn)生輔色效應(yīng)，增加了花色苷的穩(wěn)定性，且單寧酸和芥子酸對花色苷的輔色作用較為顯著。隨著貯藏溫度升高，花色苷降解速率加快，5 種酚酸輔色效果減弱，在37 ℃下貯藏6 d，對照組花色苷保留率降為35.27%，單寧酸、阿魏酸、芥子酸、綠原酸和丁香酸輔色組花色苷保留率分別為50.64%、38.41%、49.22%、45.37%和42.77%。

圖1 酚酸對楊梅清汁貯藏期間花色苷保留率的影響Fig.1 Effects of phenolic acids on anthocyanin retention in Chinese bayberry juice during storage

如表1所示，在25 ℃和37 ℃加速實驗條件下，楊梅清汁花色苷降解動力學(xué)與一級反應(yīng)擬合的決定系數(shù)較高，R2均在0.95以上。在4 ℃貯藏溫度下，花色苷降解速率常數(shù)k最小，半衰期T1/2最大，且貯藏溫度越高，k越大，T1/2越短。3 種不同的貯藏溫度下，與對照組相比，添加酚酸輔色的楊梅清汁花色苷的k均下降，T1/2變長，其中單寧酸和芥子酸輔色組的花色苷穩(wěn)定性提高較為顯著。在4 ℃貯藏溫度下，對照組的T1/2為77.882 d，單寧酸和芥子酸輔色組T1/2分別達(dá)154.033 d和157.533 d，分別較對照組延長76.151 d和79.651 d，輔色效果十分明顯。

表1 酚酸輔色的楊梅清汁花色苷降解動力學(xué)參數(shù)Table1 Degradation kinetic parameters of anthocyanins in Chinese bayberry juice

2.2 酚酸輔色對楊梅清汁貯藏期間色澤穩(wěn)定性的影響

圖2 酚酸對楊梅清汁貯藏期間色澤穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of phenolic acids on color stability of Chinese bayberry juice during storage

由圖2A可知，在貯藏過程中，楊梅清汁的a*值整體呈下降趨勢。在4 ℃貯藏溫度下，酚酸輔色的楊梅清汁a*值與對照組無顯著差異（P＞0.05）（圖2A1）；而在加速實驗條件下，酚酸輔色的楊梅清汁紅度a*值下降速率小于對照組（圖2A2、A3），說明輔色作用使得楊梅清汁保持a*值長時間穩(wěn)定的能力增強(qiáng)。由圖2B可知，對于色彩飽和度C*值，加入酚酸后略微下降，貯藏期間的整體變化呈下降趨勢；且在加速實驗條件下，對照組的C*值快速下降，逐漸低于酚酸輔色組，說明加入酚酸后，楊梅清汁的色彩飽和度變得更加穩(wěn)定。為了概述顏色的變化，通過計算TCD來研究輔色后的楊梅清汁在貯藏過程中的顏色差異。由圖2C可知，在4 ℃貯藏21 d期間，楊梅清汁的TCD變化沒有明顯的規(guī)律，呈現(xiàn)上下波動的狀態(tài)，可能是低溫條件下，短時間內(nèi)楊梅清汁顏色保持穩(wěn)定；在25 ℃及37 ℃貯藏溫度下，楊梅清汁TCD隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)增大的趨勢，且對照組的TCD變化最明顯，說明相比而言對照組楊梅清汁的色澤最不穩(wěn)定，而5 種酚酸對楊梅清汁的顏色穩(wěn)定性均有增強(qiáng)作用。

為了更直觀地展現(xiàn)楊梅清汁色澤的變化，將色差值由Photoshop軟件轉(zhuǎn)換為色塊圖。在4 ℃貯藏溫度下，顏色變化較為緩慢（圖3A），無法用肉眼看出明顯差別。在25 ℃貯藏溫度下，可以看出，與第0天的色塊相比，貯藏后期的楊梅清汁色塊有褐變的趨勢（圖3B）；原因是隨著貯藏時間的延長，花色苷發(fā)生降解生成棕褐色物質(zhì)[26]。而在37 ℃貯藏溫度下可以明顯看出，對照組的楊梅清汁在貯藏期間變化最大，第21天時顏色變?yōu)榘岛谏▓D3C）。單寧酸輔色組的楊梅清汁顏色變化最小，在貯藏后期還能保持較好的色澤，芥子酸輔色組次之。

圖3 楊梅清汁在不同溫度貯藏期間的顏色樣片F(xiàn)ig.3 Color swatches for Chinese bayberry juice during storage at different temperatures

2.3 酚酸輔色對楊梅清汁貯藏期間透光率的影響

圖4 酚酸對楊梅清汁貯藏期間透光率的影響Fig.4 Effects of phenolic acids on transmittance of Chinese bayberry juice during storage

透光率是楊梅清汁的重要感官指標(biāo)之一，直接影響產(chǎn)品的品質(zhì)。如圖4所示，第0天對照組楊梅清汁透光率為95.44%，肉眼觀察清澈透明，品質(zhì)較好。加入芥子酸、綠原酸、丁香酸輔色后，透光率略有下降，分別為93.72%、94.01%、93.97%；加入單寧酸后，楊梅清汁透光率明顯下降至77.73%，出現(xiàn)肉眼可見的渾濁現(xiàn)象；阿魏酸輔色組的透光率也有所下降，下降至88.78%，但肉眼觀察差別并不明顯。在4 ℃貯藏期間，透光率基本沒有變化（圖4A）；而在25 ℃和37 ℃貯藏溫度下，單寧酸輔色組的透光率有略微的上升趨勢（圖4B、C），具體原因還有待進(jìn)一步研究，其余酚酸輔色組及對照組的透光率均呈下降趨勢。陳健初[27]在研究楊梅汁沉淀機(jī)理時發(fā)現(xiàn)沉淀物主要為蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)，方忠祥[28]研究發(fā)現(xiàn)楊梅汁渾濁物主要為蛋白質(zhì)-多酚類型的渾濁物，且即使沒有蛋白質(zhì)的參與，多酚類物質(zhì)也可聚合成為足夠大的顆粒而產(chǎn)生渾濁和沉淀物質(zhì)。故推測酚酸輔色導(dǎo)致透光率下降的主要原因可能是貯藏過程微量蛋白和多酚類物質(zhì)在溶液體系中通過疏水作用力和氫鍵作用力而相互聚合形成混濁物，或者是酚酸與楊梅汁中本身含有的多酚類物質(zhì)聚合而產(chǎn)生沉淀。

2.4 酚酸輔色對楊梅清汁貯藏期間抗氧化活性的影響

圖5 酚酸對楊梅清汁貯藏期間抗氧化活性的影響Fig.5 Effects of phenolic acids on antioxidant capacity of Chinese bayberry juice during storage

由圖5可知，單寧酸輔色組的DPPH自由基清除率最高，其次為綠原酸輔色組和芥子酸輔色組，而對照組最低。可能是由于酚酸本身也具有較強(qiáng)的抗氧化活性，所以在保留花色苷的同時自身也發(fā)揮了抗氧化作用[17]；且單寧酸為沒食子酸的聚合體，羥基數(shù)目較多，抗氧化活性較其余幾種酚酸強(qiáng)[29]。在4 ℃低溫貯藏21 d后，除對照組DPPH自由基清除率有所降低，從65.06%下降到46.22%，其余各組的抗氧化活性基本沒有變化，說明酚酸對楊梅清汁輔色的同時也很好地維持了其抗氧化活性。

2.5 酚酸輔色對楊梅清汁貯藏前后TSS含量、TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及pH值的影響

TSS是指液體或流體食品中所有溶解于水的化合物的總稱，包括糖、酸、維生素、礦物質(zhì)等[30]。TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)是指食品中所有酸性成分的總量；而pH值通常用來表示有效酸度，即被感覺器官所能感受到的酸度。酚酸輔色后的楊梅清汁貯藏期間TSS含量、TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)及pH值變化如表2所示，在4、25 ℃和37 ℃貯藏條件下，不同酚酸輔色組的TSS含量、TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)及pH值與對照組相比均無顯著性變化，且與0 d相比，貯藏結(jié)束后變化均較小，說明酚酸輔色對楊梅清汁TSS含量、TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及pH值基本無影響。

表2 酚酸對楊梅清汁貯藏前后TSS含量、TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)及pH值的影響Table2 Effects of phenolic acids on TSS and TA content and pH of Chinese bayberry juice during storage

3 結(jié) 論

利用加速貨架期實驗探究不同酚酸對楊梅清汁的輔色效果。單寧酸、阿魏酸、芥子酸、綠原酸、丁香酸5 種酚酸均對楊梅清汁花色苷具有輔色作用，顯著增強(qiáng)了楊梅清汁貯藏期間色澤穩(wěn)定性。添加酚酸后的楊梅清汁色澤更加穩(wěn)定，紅度a*值、色彩飽和度C*值和TCD變化均減緩，花色苷降解速率降低，半衰期變長，抗氧化能力增強(qiáng)，TSS含量、TA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH值無明顯變化。其中，單寧酸和芥子酸對花色苷的輔色效果最好；但單寧酸的添加對楊梅清汁的澄清度影響較大，而芥子酸能對楊梅清汁產(chǎn)生較強(qiáng)的增色效果、提高花色苷的穩(wěn)定性，且對果汁其余理化指標(biāo)影響均較小，可以作為一種輔色劑應(yīng)用于楊梅清汁。而關(guān)于實際生產(chǎn)過程中添加酚酸的楊梅清汁的口感、風(fēng)味等是否被消費(fèi)者接受仍需進(jìn)一步研究完善。