L-半胱氨酸處理對(duì)采后李果實(shí)褐腐菌的抑制作用

令 陽，鄧麗莉,2，姚世響,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

李果實(shí)皮薄多汁、酸甜可口、營養(yǎng)豐富，是我國重要的核果類水果之一[1-2]，但李果實(shí)成熟于高溫高濕的夏季，采前或采后都極易受到病原微生物的侵染而腐爛，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。其中，褐腐病是核果類果實(shí)采后主要的侵染性病害[5-6]，該病的常見病原菌主要有：美澳型核果鏈核盤菌（Monilinia fructicola（Winter）Honey）、核果鏈核盤菌（Monilinia laxa（Aderh.et RuM.）Honey）和果生鏈核盤菌（Monilinia fructigena（Aderh.et RuM.）Honey）[7]，而造成李果實(shí)褐腐病的主要致病菌是美澳型核果鏈核盤菌（M. fructicola）[4]。M. fructicola菌絲生長速度快，菌落呈現(xiàn)灰黃色的圓形同心輪紋；其分生孢子無色，形狀為檸檬形或橢圓形，M. fructicola病原菌易侵染近成熟期或成熟期果實(shí)，可在成熟果實(shí)中快速定植，傳播速度較快，易造成果實(shí)的腐爛[7-9]。李果實(shí)采后褐腐病的防治方式仍以化學(xué)殺菌劑為主[7]，但由于化學(xué)殺菌劑會(huì)造成環(huán)境的污染、危害人類的健康以及促使病原菌產(chǎn)生抗性等一系列問題而受到應(yīng)用限制[5]。目前，已有研究將一些安全且環(huán)保的殺菌劑替代品應(yīng)用于李果實(shí)采后褐腐病的防治，例如：膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens）、檸檬形克勒克酵母（Kloeckera apiculata）[5]和巴西棕櫚蠟（Copernicia cerifera wax）[10]在離體實(shí)驗(yàn)中均可抑制M. fructicola孢子的萌發(fā)和菌絲的生長，在果實(shí)實(shí)驗(yàn)中也可顯著降低李果實(shí)的采后發(fā)病率等。但現(xiàn)階段仍然需要尋找安全、環(huán)保的新型殺菌劑替代品來降低由褐腐病引起的采后李果實(shí)的爛果現(xiàn)象。

半胱氨酸作為一種公認(rèn)的安全型氨基酸，常被用作鮮切水果和蔬菜的抗褐變保鮮劑[11]。近年來，半胱氨酸也被作為一種有效的外源處理應(yīng)用于植物的抗逆境脅迫中，如L-半胱氨酸可以有效緩解鎘脅迫對(duì)黃瓜種子的傷害[12]，緩解鹽脅迫對(duì)大麥種子的傷害[13]等；但卻鮮有研究將L-半胱氨酸應(yīng)用于采后果蔬侵染性病害控制方面。本研究目的在于揭示離體條件下L-半胱氨酸對(duì)李果實(shí)褐腐病病原菌M. fructicola可能的抑制機(jī)理以及其對(duì)李果實(shí)采后褐腐病害的防治效果，為采后果蔬病害控制研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料‘青脆李’（Prunus salicina Lindell cv.‘Qingcui’）采摘于重慶市北碚區(qū)縉云山果園，采摘后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。挑選無病害、無機(jī)械傷且大小均勻、成熟度一致的果實(shí)。攤平去除田間熱后，于室溫條件下貯藏待用。

褐腐病病原菌（M. fructicola）為本實(shí)驗(yàn)室自行分離、鑒定和保存的菌種。使用前將斜面保藏的菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，并于25 ℃條件下培養(yǎng)5 d。在無菌條件下，用無菌水將M. fructicola洗下配制成高濃度的孢子懸浮液，并根據(jù)需要用無菌水調(diào)至到所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。

L-半胱氨酸（純度＞99%） 瑞士Adamas-Bata公司；SYTOX Green（SG）熒光染色試劑 美國Invitrogen Corp公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；BX43電子顯微鏡 日本Olympus公司；B203生物顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；TS100熒光顯微鏡 北京長恒榮創(chuàng)科技有限公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；UV1000紫外分光光度計(jì) 北京萊伯泰科科技有限公司；AvantiTMJ-30I高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；WD-9405B水平搖床 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola孢子萌發(fā)率的影響

培養(yǎng)基配制及孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)參考趙一潔等[14]的方法，略有修改。將L-半胱氨酸溶于無菌水配制成質(zhì)量濃度為10 000 mg/L的母液，在無菌條件下將其梯度稀釋成10、100、1 000 mg/L，并在無菌條件下各取10 mL質(zhì)量濃度為10、100、1 000、10 000 mg/L L-半胱氨酸溶液，分別加入90 mL滅菌后冷卻至50～55 ℃的PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻制成L-半胱氨酸終質(zhì)量濃度為1、10、100、1 000 mg/L的培養(yǎng)基，以添加10 mL無菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照組。

取滅菌的載玻片，將其置于含不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸的培養(yǎng)基中，待其表面形成瓊脂薄層后取出并去掉一面的瓊脂培養(yǎng)基。用微量移液槍移取10 μL 1h106個(gè)/mL的M. fructicola孢子懸浮液滴于含瓊脂培養(yǎng)基的載玻片中間部位，之后平放于培養(yǎng)皿內(nèi)的“U”形玻璃棒上，25 ℃保濕保溫培養(yǎng)4 h后在電子顯微鏡下觀察各組M. fructicola孢子的萌發(fā)情況，每次觀察，孢子個(gè)數(shù)不少于150 個(gè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。按照式（1）計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.3.2 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲體的作用

含L-半胱氨酸的PDA培養(yǎng)基配制方法如1.3.1節(jié)。菌落直徑的測(cè)定參考Zhang Zhanquan等[15]的方法，并略有修改。將配制好的含不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸溶液的PDA培養(yǎng)基倒入平板中，待培養(yǎng)基凝固后，在平板中間接種已培養(yǎng)了5 d且取自M. fructicola菌落邊緣直徑為6 mm的菌餅。將接種后的平板置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察其菌絲的生長狀況（本研究只列出2、4 d的數(shù)據(jù)），并用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲胞外電導(dǎo)率的影響

菌絲體的培養(yǎng)及胞外電導(dǎo)率的測(cè)定參考Wang Wenjun等[16]的方法，略有修改。采用電導(dǎo)率儀測(cè)定L-半胱氨酸對(duì)M. fructicola胞外電導(dǎo)率的影響。菌絲體的培養(yǎng)：將1h106個(gè)/mL的M. fructicola孢子懸浮液接種于20 mL PDB培養(yǎng)基中，將其置于培養(yǎng)條件為25 ℃、 160 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)48 h。

將培養(yǎng)48 h且含菌絲體的PDB培養(yǎng)基在4 000 r/min的條件下離心15 min，獲得的菌絲體沉淀再在相同離心條件下用無菌水離心沖洗3 次。收集離心沖洗過后的菌絲體沉淀重新懸浮于無菌水中，之后加入L-半胱氨酸溶液使其終質(zhì)量濃度分別為1、10、100、1 000 mg/L。將其繼續(xù)放入搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定搖床培養(yǎng)處理0、2、4、6、8 h時(shí)的胞外電導(dǎo)率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。用無菌水作為對(duì)照組。

1.3.4 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲胞內(nèi)核酸物質(zhì)釋放的影響

菌絲體的培養(yǎng)方法同1.3.3節(jié)。胞內(nèi)核酸物質(zhì)泄漏量的測(cè)定參考Tao Nengguo等[17]的方法，略有修改。將培養(yǎng)48 h且含菌絲體的PDB培養(yǎng)基在4 000 r/min離心15 min后用磷酸緩沖液（pH 7.0）沖洗3 次。收集離心過后的菌絲體沉淀重新懸浮于磷酸緩沖液（pH 7.0）中，之后加入L-半胱氨酸溶液使其終質(zhì)量濃度分別為1、10、100、1 000 mg/L。將其繼續(xù)放于培養(yǎng)條件為25 ℃、 160 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，在搖床培養(yǎng)處理0、2、4、6、8 h時(shí)離心，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm波長處上清液的吸光度，且其吸光度的大小與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核酸物質(zhì)的釋放量成正比。吸光度越大，表示L-半胱氨酸處理后M. fructicola菌絲胞內(nèi)核酸物質(zhì)釋放量增多。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。用無菌水作為對(duì)照組。

1.3.5 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola孢子細(xì)胞膜完整性的影響

M. fructicola孢子細(xì)胞膜完整性的測(cè)定參考Olmedo等[18]的方法，略有修改。取5 支1.5 mL的無菌離心管，分別加入90 μL 1h107個(gè)/mL M. fructicola孢子懸浮液，再分別加入10 μL質(zhì)量濃度為10、100、1 000、10 000 mg/L L-半胱氨酸溶液，使其在100 μL混合液體中的終質(zhì)量濃度分別為1、10、100、1 000 mg/L。以添加10 μL的無菌水作為對(duì)照組，將其置于25 ℃靜態(tài)培養(yǎng)4 h，加入SG試劑貯備溶液使混合液中SG的終濃度為0.2 μmol/L，制片并在熒光顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。每張載玻片隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，且在明視野以及相同位置的熒光視野下分別拍照記錄。將明視野中觀察到的孢子數(shù)定義為總數(shù)（T），熒光視野下觀察到綠色的染色孢子作為已被破壞膜結(jié)構(gòu)的孢子數(shù)（S）。按照公式（2）計(jì)算細(xì)胞膜完整性。

1.3.6 L-半胱氨酸處理對(duì)采后李果實(shí)損傷接種M. fructicola的作用效果

參考Wang Liting等[19]的方法，略有修改。用體積分?jǐn)?shù)2%次氯酸鈉浸泡果實(shí)1 min后用清水沖洗，并于常溫（20 ℃）下自然晾干。果實(shí)表面赤道部位經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭消毒，之后將其隨機(jī)分成5 組，每組10 個(gè)果實(shí)。用滅菌鐵釘在果實(shí)赤道部位等距離打2 個(gè)孔（深3 mm、直徑3 mm）。每個(gè)傷口加入10 μL 1h104個(gè)/mL的M. fructicola孢子懸浮液。2 h后，在5 組果實(shí)的每個(gè)傷口處分別加入20 μL的0（無菌水，對(duì)照）、1、10、100、1 000 mg/L L-半胱氨酸溶液。待完全吸收后，單果包裝，并于20 ℃、相對(duì)濕度80%～90%的條件下貯藏。每天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑直徑（本研究僅列出5、6、7 d的數(shù)據(jù)）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

Excel 2016軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，運(yùn)用GraphPad Prism 7、Adobe Photoshop CS6軟件繪制圖表。應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用Duncan’s多重比較進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola孢子萌發(fā)率的影響

圖1 L半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola孢子萌發(fā)的影響Fig.1 Effect of L-cysteine treatment on spore germination rate of M. fructicola

如圖1A所示，在培養(yǎng)4 h時(shí)，1 000 mg/L L-半胱氨酸處理可顯著降低M. fructicola孢子的萌發(fā)率（P＜0.05），且萌發(fā)率比對(duì)照組低36.7%。但1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組的孢子萌發(fā)率與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）。同時(shí)，從圖1B中可以看出，在培養(yǎng)4 h時(shí)，1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組及對(duì)照組的M. fructicola孢子已大部分萌發(fā)，而1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組的M. fructicola孢子萌發(fā)數(shù)較少。

2.2 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲體的影響

如圖2A所示，M. fructicola菌落直徑在含不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸的培養(yǎng)基中均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長呈上升的趨勢(shì)。在培養(yǎng)2、4 d時(shí)，1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組與對(duì)照組相比可以顯著抑制M. fructicola菌絲的生長（P＜0.05），但1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組菌落直徑與對(duì)照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。圖2B為培養(yǎng)4 d時(shí)，M. fructicola菌絲生長情況的照片，可以看出1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組與對(duì)照組的M. fructicola菌絲已基本長滿培養(yǎng)基表面，而1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組的M. fructicola菌絲僅在菌餅周圍生長。

圖2 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲體生長的影響Fig.2 Effect of L-cysteine treatment on mycelial growth of M. fructicola

2.3 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲胞外電導(dǎo)率的影響

圖3 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲胞外電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of L-cysteine treatment on extracellular conductivity of M. fructicola

由圖3可知，M. fructicola菌絲體電導(dǎo)率隨處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組的胞外電導(dǎo)率在處理2、4、8 h時(shí)與對(duì)照組相比無顯著性差異（P＞0.05），而在處理6 h時(shí)，10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組的胞外電導(dǎo)率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。1 000 mg/L L-半胱氨酸處理后，M. fructicola菌絲胞外電導(dǎo)率都極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。在處理2、4、6、8 h時(shí)，1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組的電導(dǎo)率分別為對(duì)照組的2.16、2.27、2.30、1.45倍。

2.4 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲胞內(nèi)核酸物質(zhì)釋放的影響

圖4 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola菌絲胞內(nèi)核酸物質(zhì)釋放的影響Fig.4 Effect of L-cysteine treatment on the release of intracellular constituents from M. fructicola

由圖4可知，在處理0～8 h內(nèi)，0、1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組的OD260nm變化不明顯，且1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組的OD260nm與對(duì)照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。而1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組的OD260nm隨著處理時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），在處理2、4、6、8 h時(shí)，1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組的OD260nm分別為對(duì)照組的2.11、2.29、2.54、2.37 倍。

2.5 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola孢子細(xì)胞膜完整性的影響

圖5 L-半胱氨酸處理對(duì)M. fructicola細(xì)胞膜完整性的影響Fig.5 Effect of L-cysteine treatment on membrane integrity in spores of M. fructicola

如圖5A所示，通過SG熒光染色劑和熒光顯微鏡觀察L-半胱氨酸處理4 h對(duì)M. fructicola孢子細(xì)胞膜的破壞能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組及1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組發(fā)出綠色SG熒光的M. fructicola孢子數(shù)相對(duì)較少，但經(jīng)1 000 mg/L L-半胱氨酸處理的M. fructicola孢子發(fā)出綠色SG熒光的孢子數(shù)明顯增多。且由圖5B可知，對(duì)照組以及1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組的M. fructicola孢子的細(xì)胞膜完整性保持在84%以上，而1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組的M. fructicola孢子的細(xì)胞膜完整性降低至73%左右，與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。

2.6 L-半胱氨酸處理對(duì)采后李果實(shí)損傷接種M. fructicola的控制效果

圖6 L-半胱氨酸處理對(duì)李果實(shí)褐腐病發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.6 Effect of L-cysteine treatment on disease incidence (A) and lesion diameter (B) of M. fructicola in plums during storage

如圖6所示，李果實(shí)的褐腐病發(fā)病率及病斑直徑隨貯藏時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在貯藏5～6 d時(shí)，1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組與對(duì)照組相比顯著降低了李果實(shí)損傷接種褐腐病的發(fā)病率（P＜0.05）；同時(shí)，在貯藏5～7 d，1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組與對(duì)照組相比顯著降低了李果實(shí)褐腐病的病斑直徑（P＜0.05）。1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理組在整個(gè)貯藏期內(nèi)無論是發(fā)病率還是病斑直徑與對(duì)照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)主要探討了L-半胱氨酸處理在離體條件下對(duì)褐腐病病原菌M. fructicola孢子及菌絲生長的影響，進(jìn)而探究了其在果實(shí)病害控制實(shí)驗(yàn)中的作用效果。結(jié)果表明，與L-谷氨酸在離體條件下對(duì)擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、鏈格孢（Alternaria alternate）及指狀青霉（Penicillium digitatum）無直接抑制作用的結(jié)果不同[20]，L-半胱氨酸在離體條件下對(duì)李果實(shí)褐腐病病原菌M. fructicola具有一定的抑制作用，但不同質(zhì)量濃度L-半胱氨酸處理對(duì)李果實(shí)M. fructicola的抑制情況存在明顯的差異。在前期實(shí)驗(yàn)中探究了0、1、10、100、300、500、700、1 000 mg/L L-半胱氨酸在離體條件下對(duì)M. fructicola孢子萌發(fā)及菌絲生長的影響（數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)），結(jié)果顯示500、700、1 000 mg/L L-半胱氨酸均可延緩病原菌孢子的萌發(fā)，抑制菌絲體的生長，并且隨著L-半胱氨酸處理質(zhì)量濃度增大，其對(duì)M. fructicola的生長抑制效果增強(qiáng)，其中1 000 mg/L L-半胱氨酸處理組抑制效果最強(qiáng)。這與殼聚糖[21]、檸檬酸[22]、β-氨基丁酸[23]等在離體條件下對(duì)病原菌的抑菌作用與質(zhì)量濃度成正比的結(jié)果相似。在本實(shí)驗(yàn)的4 個(gè)處理質(zhì)量濃度中，與對(duì)照組相比，只有1 000 mg/L L-半胱氨酸處理可以顯著延緩M. fructicola孢子的萌發(fā)，明顯破壞M. fructicola孢子細(xì)胞膜，使SG熒光染色劑進(jìn)入孢子內(nèi)與核酸物質(zhì)結(jié)合，從而使較多的孢子發(fā)出熒光。細(xì)胞膜是細(xì)胞與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的通道和屏障[24]，它的通透性和完整性在細(xì)胞進(jìn)行正常生理活動(dòng)中具有重要的作用[25]。細(xì)胞膜通透性的異常變化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物的大量泄露從而影響細(xì)胞的正常生理活性，這也是細(xì)胞損傷的早期表現(xiàn)[26-27]。1 000 mg/L L-半胱氨酸處理可顯著增加菌絲體胞外電導(dǎo)率，促使其菌絲體膜內(nèi)物質(zhì)的泄漏，說明菌絲體的細(xì)胞膜在一定程度上受到了破壞，這與一些精油物質(zhì)[28-29]及萜類化合物[30]抑制真菌病原菌生長的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。在果實(shí)實(shí)驗(yàn)中，青脆李果實(shí)經(jīng)1 000 mg/L L-半胱氨酸處理后的發(fā)病率和病斑直徑與對(duì)照組相比有顯著性差異；與離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，1、10、100 mg/L L-半胱氨酸處理對(duì)李果實(shí)采后褐腐病害并無顯著控制效果。同樣，β-氨基丁酸處理接種綠霉病病原菌的蘋果果實(shí)[23]與殼寡糖處理接種黑斑病病原菌的棗果實(shí)[19]也存在離體和果實(shí)實(shí)驗(yàn)有效濃度相一致的現(xiàn)象。