正交實驗在藍莓組培培養基篩選過程中的應用

陶興魁,高貴珍,張興桃,王海潮,李秀娟,孔小燕

(宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000)

藍莓(Vaccinium Spp)，別名越橘，屬于杜鵑花科越桔屬，多年生漿果類灌木，果實營養豐富。藍莓果實中的花青素可以保護眼睛、增強視力[1]，是一種抗養化劑。藍莓也是一種高纖維食品，對防止人體細胞衰老，預防老年性疾病(心臟病、白內障、癌癥、記憶力衰退等)具有特殊功效[2]，因而被國際糧農組織列為五大健康食品之一[3-4]，被譽為“黃金漿果”，在我國具有很好的市場發展前景[5-7]。藍莓常規繁殖速度較慢，且病毒感染嚴重，品種容易退化[8-9]，利用組織培養則繁殖速度較快，且能保持品種特性[10]。因此對藍莓的組織培養及快速繁殖進行了研究，探索了不同培養基、植物激素及pH對藍莓誘導叢生芽增殖的影響；不同培養基、活性炭含量、激素濃度及pH對試管苗生根的影響，從而獲得適合藍莓快速繁殖各個階段的最適培養條件。

1 材料和方法

1.1 材料

生長健壯的無病蟲害的當年生藍莓新枝條(宿州市埇橋區西二鋪藍莓苗圃基地)。

1.2 方法

(1)外植體的選擇和滅菌。幼嫩枝去掉頂梢，用清水浸泡，催芽，溫度控制在20 ℃～25 ℃。當枝條的腋芽萌發后，用自來水沖洗3 h，剪取長1.0～1.5 cm的帶腋芽莖段，用清水反復沖洗，然后在超凈工作臺上用75%酒精溶液處理30 s，無菌水沖洗數次，再用1%升汞溶液浸泡5 min，用無菌水沖洗5～6次，沖洗速度先快后慢。

(2)培養基及培養條件。分別以MS、1/2MS、改良WPM、1/2WPM為基本培養基，增添瓊脂粉7.0 g/L，蔗糖20 g/L，培養基滅菌20 min，高壓滅菌鍋設置為121 ℃、131 Kpa，培養室溫度設置為25 ℃。采用L9(34)正交表探究不同培養基、IBA、pH和ZT對外植體芽誘導的影響，實驗結果如表1所示；相同pH(5.3)，不同培養基、6-BA、ZT對叢生芽增殖的影響，結果如表2所示；不同活性炭含量、pH、NAA和ZT對試管苗生根的影響，結果如表3所示。

表1 藍莓叢生芽誘導正交實驗因素水平表L9(34)

表2 藍莓叢生芽的增殖正交實驗因素水平表L9(34)

表3 組培生根正交試驗因素水平表L9(34)

(3)誘導叢生芽萌發。以正交實驗因素水平表為依據，配制9種培養基，在莖段兩端剪除多余部分，在無菌條件下將單芽莖段接種于培養基中，每種培養基接種20瓶，每瓶4～5個，重復3次，經過40d培養統計發芽數和計算萌芽率，觀察腋芽誘導的效果和新生芽的長勢。

(4)藍莓叢生芽的增殖。將原代培養的芽切割成2 cm左右的段，轉入繼代培養基中繼續培養，每種培養基接種20瓶，每瓶4～5個，重復3次，經過30 d培養統計增殖倍數。

(5)藍莓試管苗的生根。以改良1/2WPM為基本培養基，選取生長健壯的試管苗剪切成長3 cm的尖梢，接種于生根培養基中，每種培養基接種20瓶，每瓶4～5個，重復3次，經過一個月培養后，觀察生根情況。

2 結果與分析

2.1 藍莓叢生芽的誘導

不同因素對藍莓誘導叢生芽萌發的影響極差分析如表4所示。由表4可知，3，4，9號培養基中的單芽莖段叢生芽的萌發最多，平均出芽率分別達到60.50%，52.83%和55.83%，存活率比其他培養基都高，并且長勢很好;2，6，8號培養基中叢生芽的萌發比較好，平均出芽率值是43.83%～47.17%，但是存活率較低，僅為25%;1，5，7號培養基中叢生芽的萌發次之，平均值分別為28.17%，33.00%和26.67%，存活率在25%～30%之間。

正交試驗中，極差R值越大，表明該因素在試驗中影響越顯著。通過表4極差數據分析表明，R值最大的是B因子，因子A的R值最小，即培養基對單芽莖段萌發的影響最大，而IBA影響最小，依次為培養基>ZT>pH>IBA。單從誘導叢生芽萌發的角度看，根據極差分析的結果可以發現，A1B3C2D3是藍莓單芽莖段叢生芽的萌發培養基的最佳組合。正交試驗是一種均一性設計試驗，不可能包含全部處理組合，因此A1B3C2D3在實驗中就沒有顯現出來。為驗證A1B3C2D3是最優組合，配制此種培養基20瓶進行驗證試驗，結果表明，叢生芽的萌發誘導達到85%，明顯高于正交表中的9種培養基，從而證明了A1B3C2D3是藍莓誘導叢生芽萌發的最適培養基，即1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0。

為了進一步探究各處理間及因子水平之間的不同，故進行了方差分析如表5所示。培養基、ZT的F比均大于F臨界值，影響因素均達到顯著差異(p<0.05)，而且此結果與極差分析的結果相吻合。由此可以得出，誘導藍莓叢生芽萌發的最適培養基是1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0。

表4 不同因素對藍莓誘導叢生芽萌發的影響極差分析

表5 不同因素對藍莓誘導叢生芽萌發的影響方差分析

2.2 藍莓叢生芽的增殖

不同因素對藍莓叢生芽增殖的影響的極差分析如表6所示。由表6可知，4，5號培養基中的叢生芽的增殖最多，平均增殖倍數分別達到106.67%和110.58%，存活率也比其他7種培養基都高，存活率分別達到83.33%和87.50%，并且長勢很好；3，7號培養基中的叢生芽的增殖比較好，平均增值倍數是90.00%～95.00%，存活率是54.17%～70.83%。1，2，6，9號培養基中叢生芽的增殖不好，平均值分別是62.50%～80.33%，存活率在54.17%～83.33%之間。8號培養基的叢生芽的增殖最低，平均值僅達到39.00%，且長勢很不好，存活率也非常低，僅50.00%。

通過表6極差數據分析表明，R值最大的是C因子，因子B的R值最小，即6-BA對叢生芽增殖的影響最大，而ZT影響最小，依次為6-BA>培養基>ZT。單從叢生芽增殖的角度看，從極差分析的結果可以看出，藍莓叢生芽增殖培養基的最優組合為A2B1C3。為了驗證A2B1C3是最優組合，配制此種培養基20瓶進行驗證試驗，結果表明，叢生芽增殖倍數達到150%，明顯高于正交表中的9種培養基，并且根系粗壯，須根比較少，從而證明了A2B1C3是藍莓叢生芽增殖的最適合培養基，即1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA。

不同因素對藍莓叢生芽增殖的影響方差分析如表7所示。由表7可知，因子培養基、6-BA和ZT影響因素均沒有達到顯著差異(p<0.05)，6-BA的F比值較其他的大。由此可以得出，最適合藍莓叢生芽增殖的培養基為1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA。

2.3 藍莓的組培生根

不同因素對藍莓組培生根影響極差分析如表8所示。由表8可知，4號培養基中的試管苗的生根數最多，平均生根率是74%，存活率也比較高，達到66.67%，且根不僅粗壯而且比較長；3，8號培養基中試管苗的生根數比較好，平均生根率值是70%；3，8號培養基存活率較2，6，7號培養基的存活率低，但是2，6，7號培養基生根率僅在45%～50%；1，5，9號培養基中試管苗生根數比較少，生根率均值在30%～40%之間，且存活率比較低，存活率均值在29.17%～41.67%。

由表8可知，R值最大的是D因子，因子C的R值最小，即活性炭對藍莓試管苗生根的影響最大，而pH影響最小，依次為活性炭>ZT>NAA>pH。從極差分析的結果可以得到，藍莓試管苗生根的培養基的最優組合為A2B3C2D3，在實驗中沒有顯示出來。為了進行驗證，配制該培養基20瓶進行了驗證實驗，結果顯示，試管苗生根率發達到86%，明顯高于正交表中的9種培養基，從而驗證了A2B3C2D3培養基為藍莓試管苗生根的最適宜培養基，即1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭。

表6 不同因素對藍莓叢生芽增殖的影響的極差分析

表7 不同因素對藍莓叢生芽增殖的影響方差分析

表8 不同因素對藍莓組培生根影響極差分析

不同因素對藍莓組培生根影響方差分析如表9所示。由表9可知，因子活性炭的F比值大于F臨界值，達到顯著差異(p<0.05)，因此也可以看出，活性炭是影響藍莓試管苗生根的主要因素，而且此結果與極差分析的結果相吻合。由此可以得出，藍莓組培苗生根的最適宜培養基為改良1/2WPM+1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭。

表9 不同因素對藍莓組培生根影響方差分析

3 討論與結論

實驗利用正交設計進行了極差和方差分析，比較了影響藍莓增殖的主要因素，以此篩選出了藍莓組織培養各階段適宜的培養條件。通過實驗得到如下結論：影響誘導藍莓叢生芽萌發的主要因素是培養基和玉米素(ZT)，通過試驗篩選出最適宜誘導藍莓叢生芽萌發的培養基是1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0，并且藍莓長勢良好，存活率也比較高。篩選出藍莓叢生芽增殖的最適宜培養基是1/2MS+1.0 mg/L ZT+1.5 mg/L 6-BA，叢生芽增殖倍數高達150%，分化的苗數比較多，生長比較旺盛，植株比較粗，而且比較高。藍莓試管苗生根的最適宜培養基是改良1/2WPM+1.0 mg/L ZT+0.8 mg/L NAA+pH 5.0+0.25%活性炭，試管苗生根率高達86%，根系比較粗壯，分支多，有利于試管苗移栽成活。

WPM系列培養基在藍莓初代培養、愈傷組織誘導與分化及叢生芽增殖培養中有較好的培養效果[11]。馬懷宇在高叢藍莓不定芽再生植株的研究中以WPM、1/2WPM為適合培養基[12]，本實驗得到的結果誘導藍莓叢生芽萌發的主要因素是1/2WPM和玉米素，藍莓叢生芽萌發培養基為1/2WPM+0.5 mg/L IBA+2.0 mg/L ZT+pH 5.0，與上述研究結果一致。活性炭在藍莓試管苗增殖和生根過程中起到很好的調節作用，鄭理喬[13]等研究表明，當培養基中加入100～200 mg/L的活性炭時，增殖培養效果好，而且可以防褐化，生根情況最為理想。李華娟[14]等以藍莓莖段為外植體，研究表明增殖培養基以WPM+1.0 mg/L ZT+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA最佳，生根誘導培養基則以1/2WPM+1.0 mg/L NAA+1.0 g/L活性碳為最好[13]。實驗研究表明，在生根培養基中加入0.25%活性炭，試管苗生根率高達86%，根系比較粗壯，分支多，有利于試管苗移栽成活。最適培養基的類型及培養條件與前人研究有所差異，可能是由于藍莓品種的多樣性、基因型的不同、選擇的外植體類型差別等因素。以后可以分別對不同品種的藍莓進行系統深入研究，以期獲得不同藍莓品種適宜的培養基及培養條件。