玉米芯木聚糖的提取及其相對分子質量分布研究

樊洪玉， 衛 趙 劍， 蔣劍春

(1.中國林業科學研究院 林產化學工業研究所;生物質化學利用國家工程實驗室;國家林業和草原局 林產化學工程重點實驗室;江蘇省 生物質能源與材料重點實驗室, 江蘇 南京 210042;2.中國林業科學研究院 林業新技術研究所, 北京 100091)

隨著石油、煤炭等不可再生化石資源總量日趨減少，由可再生植物纖維生物質資源轉化獲得新材料、高熱值能源、化工原料及藥物正成為一種重要的發展趨勢[1]。其中，農林廢棄物是可再生的、價廉易得且具有發展前景的生物質資源。在植物原料中，半纖維素是除纖維素以外的第二大組分[2]，主要存在于植物的細胞壁中。在細胞壁中半纖維素與纖維素和木質素相互連接，與纖維素主要是通過物理作用(即氫鍵)緊密結合，并通過共價鍵(主要是R-芐基醚鍵)與木質素相連接[3]。由于植物纖維中的各組分相互交聯且緊密結合，所以很難將與纖維素和木質素相連的半纖維素分離出來[4]。因此尋找一種既能最大限度地將半纖維素分離出來，又能盡量減少或避免其在提取過程中發生變化的方法，是實現半纖維素綜合利用的關鍵。我國是農業生產大國，每年產生幾億噸的農業廢棄物。若就地燃燒或掩埋不僅會污染環境，而且還會造成大量的資源浪費。玉米芯中半纖維素高達41%左右，且為聚木糖類半纖維素，已廣泛用于制備糠醛、低聚木糖(XOS)等多種工業產品[5]。近年來，研究者開始利用玉米芯半纖維素來開發高附加值的化學品和醫藥產品，并期望其能應用于工業化生產[6]。由于半纖維素屬于天然產品，分離過程中結構多變，致使制備的半纖維素產品分散度高，為相對分子質量大小不一的混合體。若不加以純化，易造成后續產品性能不穩定，關鍵技術參數難以確定，進而難于大規模工業化生產。因此，制備分散度低、性能穩定的半纖維素是其高附加值工業化應用的基礎。目前，提取半纖維素(木聚糖)的方法主要有溶劑法、堿法、酸法、酶法以及附加物理、化學的輔助方法等。由于酸法制備木聚糖易降解、對設備腐蝕性大，溶劑法和酶法處理量小、效率低。因此，本研究選擇堿性過氧化氫溶液對玉米芯木聚糖進行提取分離，采用單因素試驗考察了不同工藝參數對提取得率的影響，從而確定了最佳工藝；再采用乙醇分級沉淀法制備低分散度的木聚糖，并采用多種方法對產物結構進行了分析與表征，以期為玉米芯半纖維素的高值化利用提供參考。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

玉米芯取自山東省聊城市，經自然風干后，選擇無霉變、無蟲蛀的玉米芯，破碎，過250 μm篩。將得到的玉米芯粉末用質量分數為95%乙醇溶液在索氏提取器中抽提12 h，脫除蠟質[7]，用去離子水洗滌，真空干燥，置于干燥器中備用。原料的主要化學組成可參照美國國家可再生能源實驗室標準NREL/TP-510- 42618測定，測得玉米芯原料含纖維素39.03%、半纖維素33.18%和木質素14.23%。

無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸、過氧化氫等，均為市售分析純；D-木糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等標準品，均為色譜純，西格瑪-奧德里奇(上海)貿易有限公司。

Dionex ICS-3000戴安多功能離子色譜儀，ED電化學檢測器，色譜柱為CarbopacTM PA-20柱(4 mm×250 mm)；Thermo Fisher Nicolet iS 10傅里葉紅外光譜(FT-IR)儀；Bruker WNMR-I-500MHz型核磁共振(NMR)波譜儀；美國TA公司Q50型熱重(TG)分析儀。

1.2 玉米芯木聚糖的制備

將脫蠟后的玉米芯粉末50 g加入1 000 mL去離子水，75 ℃抽提3 h以獲得水溶性多糖(WSP)。固液分離，向濾渣中加入堿性過氧化氫溶液(1% H2O2和5% NaOH)，在不同的反應條件下進行加熱反應。反應結束后，減壓過濾，用鹽酸中和至pH值為中性，減壓濃縮，向濃縮液中加入定量的無水乙醇，靜置過夜，離心分離，使用體積分數為75%的乙醇溶液洗滌固體沉淀，以除去表面附著的無機鹽和反應過程中生成的小分子物質，最后冷凍干燥即得到木聚糖產品，放入干燥器中保存備用。木聚糖得率按下式計算：

y=m/m0×100%

式中：y―木聚糖得率，%;m—乙醇沉淀的木聚糖的質量,g;m0—玉米芯中半纖維素的總質量,g。

1.3 梯度乙醇分級沉淀法分離玉米芯木聚糖組分

在最佳條件下提取的半纖維素提取液中加入乙醇，使濾液中乙醇體積分數為10%、20%、30%、45%、60%和75%，離心分離，固體沉淀經洗滌后得到木聚糖產品，采用冷凍干燥和真空干燥2種方式進行干燥，干燥后的木聚糖樣品分別標記為D10～D75和H10～H75。

1.4 分析與表征

1.4.1糖組分分析 使用高效陰離子交換色譜測定所制備木聚糖的糖類組分和含量。準確稱取150 mg(精確到0.1 mg)的樣品放入三角瓶中，然后加入1.50 mL的72%的硫酸，攪勻，放在(30±3) ℃恒溫搖床中60 min。隨后使用42.00 mL去離子水將其沖洗到壓力瓶中，使硫酸質量分數為4%，搖勻，放入高壓釜，在121 ℃下對樣品及標樣水解1 h，冷卻到室溫。酸解液稀釋一定倍數后，過0.22 μm微孔水相濾膜后進行糖組分分析。每個實驗做3～6個平行，取平均值。

1.4.2FT-IR分析 對制得的低分散度木聚糖樣品進行紅外光譜分析，儀器的分辨率優于4 cm-1，樣品的掃描次數為16次/s，掃描波數范圍為525～4000 cm-1。

1.4.3NMR分析 將木聚糖樣品(1H NMR 20 mg，13C NMR 80 mg)溶于1 mL含有少量NaOD的D2O中。其中1H NMR譜的掃描數為2 000，13C NMR譜的掃描數為10 000，脈沖寬度均為11.5 μs，延遲時間均為2 s。

1.4.4TG分析 對木聚糖產品進行熱穩定性分析，在N2氣氛中，將樣品以10 ℃/min的升溫速率由50 ℃升至600 ℃，分析低分散度木聚糖產品的熱失重行為。

1.4.5相對分子質量測定 通過凝膠滲透色譜(GPC)來測定木聚糖的相對分子質量，木聚糖的多分散性系數(D)可以使用重均相對分子質量(Mw)與數均相對分子質量(Mn)的比值來表示。檢測所用色譜柱型號為Waters styrage HT6，柱溫箱溫度為25 ℃，檢測器為SFD RI-2000示差折光檢測器，流動相為0.001 mol/L NaOH溶液，流速為1 mL/min，進樣質量濃度0.2 g/L。

2 結果和討論

2.1 不同條件對木聚糖提取得率的影響

2.1.1堿質量分數 NaOH質量分數是影響玉米芯木聚糖得率的關鍵因素，在反應時間為16 h，液固比為20∶1(mL∶g,堿性過氧化氫溶液體積與玉米芯質量比，下同)，反應溫度為50 ℃，過氧化氫質量分數為1%的條件下，考察了NaOH質量分數(2.5%、5%、7.5%和10%)對玉米芯木聚糖得率的影響，結果見圖1(a)。由圖可知，當NaOH質量分數由2.5%增加到5%時，玉米芯木聚糖得率從75.82%增加到最大值83.15%。當堿質量分數超過5%時，隨著堿質量分數的增加，玉米芯木聚糖的得率急劇下降。當堿質量分數增加至10%時，大部分木聚糖發生了水解，得率僅為32%。因此，選擇NaOH質量分數為5%。

2.1.2液固比 液固比在堿性過氧化氫溶液提取玉米芯木聚糖的過程中具有重要的作用，在反應溫度為50 ℃，反應時間為16 h，NaOH質量分數為5%的條件下，考察了液固比(10∶1、 15∶1、 20∶1、 25∶1)對玉米芯木聚糖得率的影響，結果見圖1(b)。由圖可知，隨著堿性過氧化氫溶液(1%H2O2，5%NaOH)體積的增加，玉米芯木聚糖的得率也逐漸增加。當液固比由10∶1增加到20∶1時，玉米芯木聚糖的得率由56.45%迅速增加到80.44%。但是繼續增加堿性過氧化氫溶液的體積，玉米芯木聚糖的得率基本不變。因此選擇最佳液固比為20∶1。

2.1.3反應溫度 反應溫度過低木聚糖很難充分提取，反應溫度過高會使木聚糖糖鏈發生降解，從而導致木聚糖的得率降低。在堿性過氧化氫溶液(1% H2O2，5% NaOH)中，反應時間為16 h，液固比為20∶1的條件下，考察了反應溫度(40、45、50、55和60 ℃)對玉米芯木聚糖得率的影響，結果見圖1(c)。由圖可知，當反應溫度從40 ℃升到50 ℃時，玉米芯木聚糖的得率迅速增加。在50 ℃玉米芯木聚糖得率達到最大值83.15%。繼續增加反應溫度，玉米芯木聚糖的得率反而有所下降。這可能是因為反應溫度過高，導致玉米芯木聚糖發生了降解。因此，選擇反應溫度為50 ℃。

2.1.4反應時間 反應時間是影響玉米芯木聚糖得率的另一重要參數，在堿性過氧化氫溶液(1% H2O2，5% NaOH)中，當反應溫度為50 ℃，液固比為20∶1時，考察了反應時間(10、12、14、16、18和20 h)對玉米芯木聚糖得率的影響，結果見圖1(d)。由圖可知，當反應時間為10～14 h時，隨著反應時間的增加，玉米芯木聚糖的得率由30.81%迅速增加至80.44%；14～16 h時，玉米芯木聚糖得率的增長速度變慢，16 h的木聚糖得率達到最大值83.15%；繼續延長反應時間至20 h時，玉米芯木聚糖的得率幾乎不變。因此，選擇最佳反應時間為16 h。

a. NaOH質量分數NaOH mass fraction; b. 液固比值liquid to solid ratio; c. 反應溫度temperature; d. 反應時間time

綜上，提取玉米芯木聚糖的最佳工藝為堿性過氧化氫溶液(1% H2O2，5% NaOH)中、反應溫度50 ℃、反應時間16 h、液固比為20∶1，在此條件下所得玉米芯木聚糖的得率為83.15%。

2.2 梯度乙醇分級沉淀法分離玉米芯木聚糖組分

2.2.1乙醇體積分數對各級分得率的影響 在熱水抽提之后，得到0.49%的水溶性多糖(WSP)。當乙醇體積分數為10%、20%、30%、45%、60%和75%時，可以分別沉淀出10.3%、3.6%、4.2%、1.6%、1.3%和1.7%的木聚糖各級分。與較高體積分數的乙醇相比，較低體積分數的乙醇可以使較多的木聚糖級分沉淀出來。通過梯度乙醇分級沉淀法從玉米芯中提取的木聚糖占干燥脫蠟玉米芯總量的22.7%，得率為68.41%。

2.2.2單糖組分分析 WSP和梯度乙醇沉淀法制備玉米芯木聚糖的單糖組分含量分析如表1所示。從表1可以看出，WSP中含葡萄糖最高，為48.93%，其次是木糖為32.24%，并且還含有少量的阿拉伯糖和半乳糖，分別為9.43%和3.37%，表明WSP是由葡聚糖、木聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖組成的[8-9]。然而，在WSP中并沒有檢測到葡萄糖醛酸，表明葡萄糖醛酸很難通過熱水抽提法從植物原料中提取出來[10]。盡管WSP是提取過程中的重要多糖之一，但它主要含有葡萄糖，并且在本實驗提取條件下得率僅為0.49%。因此，本研究將重點考察梯度乙醇分級沉淀法提取的堿溶性木聚糖組分。

梯度乙醇分級沉淀法分離得到的木聚糖組分中，糖成分主要包括43.96%～63.73%的木糖、10.89%～23.18%的阿拉伯糖、8.35%～17.47%的葡萄糖和5.01%～20.16%的半乳糖，而含葡萄糖醛酸僅為0.4%～3.14%。葡萄糖來自葡糖醛酸阿拉伯木聚糖和木葡聚糖，而半乳糖來自阿拉伯半乳聚糖，少量的葡萄糖醛酸可能是4-O-甲基葡萄糖醛酸以支鏈的形式存在[11-14]。木質素的含量隨著乙醇體積分數的增加而增加，說明分級沉淀的過程中乙醇體積分數越高，木質素含量也就越高。采用不同的干燥方式進行干燥時，只要分級沉淀時乙醇的體積分數相同，其沉淀下來的木聚糖具有類似的化學組成，這表明干燥方式對木聚糖各級分的組成影響較小。通常采用阿拉伯糖與木糖的比率來表示木聚糖聚合物的線性或支化程度[15]。由表1可知，隨著乙醇體積分數從20%增加到75%，采用冷凍方式干燥的木聚糖中w(阿拉伯糖)/w(木糖)從0.19增加至0.51，說明隨著乙醇體積分數的升高，更多支化的木聚糖被沉淀出來，即較高體積分數的乙醇有利于支化木聚糖的析出，也就是說，可以在較低乙醇體積分數下回收線性木聚糖，而在較高乙醇體積分數下獲得更多支鏈木聚糖。同樣地，采用真空干燥方式干燥的木聚糖級分也具有類似的變化趨勢。

表1 梯度乙醇沉淀法制備低分散度木聚糖的單糖組成

1)WSP:水溶性多糖water-soluble polysaccharide;D:冷凍干燥freeze-dried;H:真空干燥oven-dried

2.3 木聚糖的分析與表征

2.3.1FT-IR分析 梯度乙醇分級沉淀法獲得的木聚糖的FT-IR如圖2所示。

a. 冷凍干燥freeze-dried; b. 真空干燥oven-dried圖2 不同干燥方式時由梯度乙醇沉淀法制備的木聚糖的FT-IR圖Fig.2 FT-IR spectra of xylan by graded ethanol precipitation with different dry methods

在3362和2882 cm-1處的強吸收峰分別為O—H伸縮振動和C—H伸縮伸展[16]。1606 cm-1為H—O—H角振動，歸因于支化和水合程度，說明化合物中存在結合水[10]。1375 cm-1的弱吸收帶為C—H伸縮振動。1249 cm-1處的弱吸收峰與O—H或者C—O彎曲振動有關[17]。D75、H75、D60和H60在波數1508 cm-1附近出現弱吸收，為木質素的芳環振動吸收峰[18]。在1164 cm-1有弱吸收，表明側鏈存在阿拉伯糖基。1036 cm-1處的吸收峰為半纖維素的特征吸收，為醚鍵(C—O—C)的伸縮振動[16]。895 cm-1處有較強的吸收峰，為C1—H彎曲振動，屬于β-D-木糖的特征結構，表明糖單元之間以β-糖苷鍵連接。由圖2(a)和(b)對比可知，干燥方式不會改變物質的化學結構，特征官能團不變，所以說二者作用是相同的。

2.3.2核磁共振分析 在乙醇體積分數為10%的溶液中沉淀獲得的木聚糖(D10)通過1H NMR分析表征其結構特征，見圖3(a)。在δ4.76處的強信號峰是由殘留溶劑(D2O)引起的。δ3.0～4.3之間的主要信號是由吡喃型木糖單元引起的，是其特征信號峰，說明梯度乙醇沉淀法提取玉米芯得到的多糖主要成分為木聚糖。其中δ4.23為H-1信號峰，δ3.88為與C-5相連的平伏鍵上的H的峰，δ3.567為H- 4信號峰，δ3.29為H-3信號峰，δ3.20為與C-5相連的直立鍵上的H的峰，δ3.10為H-2信號峰。δ5.09 的信號峰為通過C-3和C-2(二取代)與木糖骨架相連接的L-呋喃阿拉伯糖端基的異頭質子[19-20]。木聚糖D30的1H NMR光譜(圖3(b))與之類似。

1H NMR: a. D10; b. D30; 13C NMR: c. D10; d. D30圖3 不同樣品的1H NMR和13C NMR圖Fig.3 1H NMR and 13C NMR spectra of different samples

為更深入了解木聚糖的分支結構，對D10和D30進行13C NMR分析。D10的13C NMR譜(圖3(c))顯示有δ105.06(C-1)、78.58(C- 4)、77.70(C-3)、76.04(C-2)和65.99(C-5)5個主要信號峰，為(1→4)-β-D-吡喃木聚糖。δ83.07和89.07為連接在α-D-木聚糖上的α-L-阿拉伯呋喃糖殘基。δ112.14對應(OCH3- 4)4-O-甲基-α-D-葡糖醛酸[21]。D30的13C NMR光譜(圖3(d))也呈現出類似的一般特征。以上結果表明，通過梯度乙醇沉淀法提取玉米芯得到的多糖主要為L-阿拉伯糖-(4-O-甲基-D-葡糖醛酸)木聚糖。

2.3.3TG分析 梯度乙醇分級沉淀法制備的低分散度木聚糖的TG、DTG曲線如圖4所示。通過觀察各個級分的熱重曲線可知，D30在230 ℃左右出現明顯的熱損失峰，D45在116、130 ℃出現熱損失雙峰，D60在100～300 ℃連續出現4重熱損失峰。H30在200 ℃左右出現明確的玻璃化轉變溫度(Tg)，H45在123 ℃左右出現Tg，H75則逐步降解。該現象說明D45、D60由2～4種不同的分子鏈段構成，D75更接近于體型高聚物降解曲線。根據表1各級分組成分析，造成以上差異的主要原因可能是級分中分子鏈段組成不同；木質素含量的差異，支化度不同，其中H75支化程度最高；阿拉伯糖含量明顯高于前3種級分。各級分的熱穩定性分析，為后續改性反應對糖級分的選擇提供了參考。

冷凍干燥freeze-dried: a. TG; c. DTG真空干燥oven-dried: b. TG; d. DTG圖4 不同干燥方式時由梯度乙醇沉淀法制備的低分散度木聚糖的TG和DTG曲線Fig.4 TG and DTG curves of low dispersion xylan from corncob by graded ethanol precipitation with different dry methods

2.3.4相對分子質量分析 通過凝膠滲透色譜法(GPC)測定梯度乙醇沉淀法提取木聚糖的Mw、Mn和D(Mw/Mn)，結果見表2。由表2可知，通過冷凍干燥得到的木聚糖的Mw在108 533至197 752之間，而真空干燥的木聚糖的Mw在41 231至47 242之間。這是由于在干燥過程中脫水方式的不同造成的，在真空干燥中木聚糖糖鏈隨水分蒸發而發生斷裂，導致相對分子質量下降；而冷凍干燥直接通過冰升華除去水分，有利于保持木聚糖的原始結構。當乙醇體積分數從10%增加到20%時，Mw明顯減小。在乙醇體積分數為20%時，得到了相對分子質量最小的木聚糖。但是，當進一步提高乙醇體積分數時，無論是真空干燥還是冷凍干燥得到的木聚糖的Mw和Mn均有所增加。此外，通過梯度乙醇沉淀法得到的木聚糖的D值均較小，除H60外，其他級分均小于1.5，從而導致更窄的相對分子質量分布，表明各梯度下得到的木聚糖的結構均勻，化學性質相似。由此可以得出，梯度乙醇分級沉淀法制備得到了多分散性指數小、相對分子質量分布窄的低分散度木聚糖，可以作為木聚糖衍生化學品和醫藥用品的原材料。

表2 梯度乙醇沉淀法得到的木聚糖的Mw、Mn和D(Mw/Mn)

3 結 論

3.1以玉米芯為原料，采用堿性過氧化氫溶液提取半纖維素，通過單因素試驗考察了不同條件對玉米芯木聚糖提取得率的影響，得到最佳的提取條件為在1%H2O2，5%NaOH的堿性過氧化氫溶液中，反應溫度50 ℃、反應時間16 h、液固比為20∶1(mL∶g)，木聚糖得率為83.15%。

3.2采用梯度乙醇分級沉淀法對堿性過氧化氫提取的木聚糖進行分級分離，經離子色譜、FT-IR、NMR和TG分析可知，不同梯度沉降下來的各級分具有相似的糖組成，主要由L-阿拉伯-(4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸)木聚糖構成。

3.3冷凍干燥的木聚糖Mw為108 533～197 752，真空干燥的木聚糖的Mw為41 231～47 242；并且各級分的木聚糖多分散系數均較小(1.172～1.517)，其中11種樣品均小于1.5，為相對分子質量分布窄的低分散度木聚糖。