miR-1187靶向調控Arhgef9在七氟醚致海馬神經元凋亡中的作用

孫華琴 梁哲浩 徐孝平 胡弘毅 陶濤

miRNA是由19～22個核苷酸組成的非編碼微小內源性RNA，廣泛存在于真核細胞中，主要參與正常情況下生長發育基因調控，它能通過不完全互補、抑制翻譯、完全互補等方式特異性作用于靶mRNA，從而調控基因表達[1-2]。miRNA由真核生物細胞核內的DNA編碼，作用于 3′非翻譯區（3′untranslated region，3′UTR），最終通過抑制mRNA轉錄或目標mRNA降解的方式，使靶基因表達下調；或開放某些mRNA的轉錄，使在多個水平對內源性基因表達進行調節[3-4]。miRNA涉及許多生物學過程的基因表達，如細胞增殖、凋亡及代謝等生物學過程，目前人類基因組中近一半基因受到2 558個成熟miRNA的調控[5]。吸入麻醉藥七氟醚是臨床常用的一種麻醉藥，可能通過興奮γ-氨基丁酸受體產生麻醉作用，誘導大鼠海馬神經元凋亡，引起認知功能障礙[6]。海馬作為中樞神經系統的重要部分，其主要生理功能是調節學習、記憶及認知功能；因此，認知功能障礙的主要機制是海馬神經元的凋亡增加[7-8]。研究證實，miRNA可參與調節海馬神經元損傷的過程，但具體機制尚未明確，對miRNA的靶基因調控研究也停留在預測階段[9]。因此，筆者嘗試通過miRNA及表達譜芯片的研究方法來探討七氟醚致海馬神經元損傷模型中miRNA與mRNA的共表達互作網絡，篩選出差異表達的miRNA，并找出其作用的靶基因。

1 材料和方法

1.1 海馬神經元原代培養模型的制備 SPF級雌性ICR小鼠4只，孕15d，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供[SCXK（滬）2013-0016] ，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心屏障動物實驗設施[SYXK（浙）2013-0184] ，室溫（23±2）℃，相對濕度 60%～70%。在其產下的新生小鼠中，按照隨機數字表法選取健康7日齡雄性ICR小鼠6只，分成兩組，即七氟醚麻醉組3只、對照組3只。七氟醚麻醉組小鼠從9:00～15:00連續6h置于自制有機玻璃麻醉箱（體積40cm×35cm×30cm）中實施麻醉，箱內置入鈉石灰紗包。經歐美達（NURACO）揮發罐給予七氟醚（日本丸石制藥株式會社）吸入，氧流量4.5L/min，使用NURACO麻醉氣體濃度監測儀測定麻醉箱中七氟醚濃度，使其穩定在2.4%。對照組小鼠在另一箱內在相同時間段連續6h持續輸入不含七氟醚的空氣。麻醉結束后，回歸鼠籠，由母鼠喂養小鼠至第14天。

1.2 差異表達miRNA篩選、調控靶基因預測和通路功能富集分析 小鼠斷頭取海馬組織，提取總RNA。樣品總 RNA 利用 Nano Drop ND-2000（Thermo Scientific）定量并經 Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）檢測RNA完整性。首先總RNA去磷酸化、變性，再用Cyanine-3-CTP（Cy3）標記，標記好的RNA純化后和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）掃描得到原始圖像。使用Feature Extraction軟件（version 10.7.1.1，Agilent Technologies）處理原始圖像，提取原始數據。使用Genesrping軟件（version 12.5，Agilent Technologies）進行quantile標準化和后續處理。利用t檢驗的P值和倍數變化值進行差異表達miRNA 篩選。利用數據庫（Target Scan，miRNA org，pita）共同對差異miRNA靶基因進行預測，然后對靶基因進行GO和Pathway富集分析，以判定差異表達的miRNA主要影響的生物學功能或通路。

1.3 海馬原代細胞培養 用75%乙醇消毒，鈍性分離腦組織中的海馬，將其剪碎并用0.25%胰蛋白酶和0.04g/L DNA酶作用3min，吸管吹打組織塊以分散細胞。將細胞懸液經75μm尼龍網過濾加入含10%FBS、5%馬血清達爾伯克改良伊格爾培養基（DMEM）完全培養液，置于培養箱內培養（37℃、5%CO2+95%O2混合氣體，飽和濕度）。第3天加入5μmol/L阿糖胞苷，24h后換成完全培養液。

1.4 miR-1187 mRNA表達的檢測 采用RT-PCR法。Trizol法提取海馬神經元總RNA，并逆轉錄成cDNA，進行RT-PCR（試劑盒購于日本TAKARA公司）。通過計算循環閾值CT值來確定miR-1187 mRNA相對表達量。ΔΔCT=（CT 值實驗組基因-CT 值實驗組管家基因）-（CT 值對照組目的基因-CT 值對照組管家基因），目的基因 mRNA 相對表達量=2-ΔΔCT。

1.5 miR-1187轉染后海馬神經元存活率的檢測 采用細胞計數試劑盒（CCK-8）法。將miR-1187高表達質粒（miR-1187 mimics）轉染成功后的海馬神經元制備成細胞懸液，接種到 96孔板中（100μl/孔），在 37℃、5%CO2條件下培養48h。更換培養基，加入10μl CCK-8（日本同仁公司），置于37℃、5%CO2條件下培養2h。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，計算細胞存活率。

1.6 熒光素酶活性檢測 用生物信息學技術檢索miR-1187靶基因數據庫Target Scan，經分析發現在Rho鳥苷交換因子-9（Arhgef9）基因 mRNA的3′UTR 有miR-1187的結合位點，提示Arhgef9是miR-1187潛在的靶基因。將Arhgef9-3′UTR片段克隆到熒光素酶報告載體中，構建成luci Arhgef9-3′UTR質粒，將此質粒與miR-1187 mimics共轉至細胞中[分為4組：共轉染陰性對照序列和野生型Arhgef9 3′UTR（A組）、共轉染miR-1187 mimics和野生型 Arhgef9 3′UTR（B 組）、共轉染陰性對照序列和突變型Arhgef9 3′UTR（C組）、共轉染 miR-1187 mimics和突變型Arhgef9 3′UTR（D 組）] 。收集轉染48h后海馬神經元，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，使用熒光發光檢測儀測定細胞中螢火蟲熒光素信號及海腎熒光素信號，計算熒光素酶活性。

1.7 統計學處理 應用SPSS 22.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達的miRNA調控靶基因預測 本研究預測得到差異表達的miRNA 9個，其對應靶基因1 252個，靶基因去重后1 095個。9個miRNA分別為miR-101b-3p、miR-1187、miR-188-5p、miR-219a-5p、miR-338-3p、miR-425-5p、miR-467a-3p、miR-705、miR-92a-3p。筆者剔除了連接度為1的相關靶基因，使網絡更加清晰分明，同時排除其他靶基因的影響，只顯示關鍵miRNA及其對應關鍵靶基因，節點信息見圖1（插頁）。

2.2 靶基因通路功能富集分析 靶基因主要富集在FoxO信號通路、mTOR信號通路、wnt信號通路等。通路功能富集分析結果，見圖2（插頁）。

2.3 海馬神經元miR-1187 mRNA表達 海馬神經元培養48h后，七氟醚誘導損傷模型組miR-1187 mRNA相對表達量為0.66±0.12，較質粒陰性對照組0.92±0.12和miR-1187 mimics組1.65±0.14均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。

2.4 miR-1187 mimics轉染后海馬神經元存活率miR-1187 mimics轉染后，海馬神經元存活率為（1.21±0.13）%，較對照組（0.89±0.11）%、質粒陰性對照組（0.87±0.12）%均明顯上升（均P＜0.05），差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖 4。

2.5 熒光素酶實驗檢測miR-1187與Arhgef9的結合 用生物信息學技術檢索miRNA靶基因數據庫Target Scan，經分析發現在Arhgef9基因mRNA的3′UTR有miR-1187的結合位點，提示Arhgef9是miR-1187潛在的靶基因，miR-1187上調可能會調控Arhgef9。miR-1187-mimics與野生型Arhgef9 3′UTR共轉染組細胞中熒光素酶活性為0.38±0.05，較其他3組熒光素酶活性1.05±0.20、1.10±0.19 和 0.99±0.11 均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；其他3組熒光素酶活性兩兩比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。這說明miR-1187與Arhgef9存在靶向關系，提示miR-1187能通過與Arhgef9基因mRNA的3′UTR互補配對來發揮作用，見圖5。

圖3 海馬神經元miR-1187 mRNA表達（與其他兩組比較，*P＜0.05）

圖4 miR-1187 mimics轉染后海馬神經元存活率（與其他兩組比較，*P＜0.05）

圖5 熒光素酶實驗驗證miR-1187與Arhgef9 3'UTR的結合（與其他3組比較，*P＜0.05）

3 討論

miRNA是涉及許多生物學過程基因表達的已知有效調節劑，參與細胞增殖、分化、凋亡以及生物的發育、神經分化、脂肪代謝等生物學過程，通過與miRNA轉錄物的3′UTR結合來調控基因轉錄后表達，廣泛地負調控靶基因的表達[10-11]。miRNA可能在基因表達調控領域具有重要作用。miRNA具有豐富多樣的序列、結構、豐度和表達方式，可影響個體發育的基因表達、細胞周期調控等重要過程。以單鏈形式存在的miRNA可通過與下游靶端UTR不完全互補配對結合，調節并影響內源基因的表達，從而影響蛋白質的合成，調節生物的發育過程[12-14]。因為在物種之間具有系統進化上的高度保守性、時序性和組織特異性，因此本研究擬通過微陣列芯片技術檢測處理后小鼠海馬區腦組織與正常小鼠海馬區腦組織中的表達譜，找出差異表達的miRNA，并分析其與海馬神經元損傷的相關性。

鑒于基因芯片的種種優勢，筆者通過構建七氟醚誘導小鼠海馬神經元損傷模型，同時利用基因芯片分析法對比小鼠海馬區腦組織和正常小鼠海馬區腦組織中的表達譜，結果預測得到差異表達的miRNA 9個，分別為miR-101b-3p、miR-1187、miR-188-5p、miR-219a-5p、miR-338-3p、miR-425-5p、miR-467a-3p、miR-705、miR-92a-3p，并從中選出上調最明顯的miR-1187進一步驗證與分析。本研究結果發現，在七氟醚誘導海馬神經元損傷模型中，miR-1187 mRNA相對表達量明顯降低，miR-1187 mimics轉染后，海馬神經元存活率明顯上升；這說明miR-1187可明顯調控海馬神經元活性，產生抗海馬神經元凋亡的作用。同時研究結果顯示，在Arhgef9基因mRNA的3′UTR有miR-1187的結合位點，提示Arhgef9是miR-1187潛在的靶基因，miR-1187上調可能調控Arhgef9，說明miR-1187與Arhgef9存在靶向關系，提示miR-1187能通過與Arhgef9基因mRNA的3′UTR互補配對來發揮作用，從而參與細胞凋亡的調控。

綜上所述，miR-1187是海馬神經元抗細胞凋亡的抑制因子；高表達miR-1187通過靶向調節Arhgef9 mRNA的表達來抑制海馬神經元凋亡的發生。