肺動脈高壓大鼠肺部炎癥與CD4+T淋巴細胞上Cx40、Cx43的相關(guān)性研究①

范志茹 倪 欣 單莉婭 張愛梅 馬克濤

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，教育部重點實驗室，石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)三科,石河子 832000)

肺動脈高壓(Pulmonary arterial hypertension,PAH)是一組由各種機制引起的以肺血管阻力持續(xù)增加為特征的臨床綜合征,其主要的病理過程為肺血管持續(xù)收縮、血管壁重塑，進而形成原位血栓，導(dǎo)致右心負荷增加、功能不全，最終嚴重影響患者生存質(zhì)量和預(yù)后[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥應(yīng)答在肺動脈高壓的發(fā)病過程中具有重要作用[3-5]。在PAH患者及動物模型中，重構(gòu)的肺動脈周圍、心臟及肺組織中都有明顯的炎癥細胞浸潤[6,7]。T淋巴細胞作為主要反應(yīng)免疫系統(tǒng)功能的重要指標，其亞群CD4+T細胞和CD8+T細胞發(fā)揮主要的作用[8]。在PAH大鼠的肺組織中，炎性浸潤細胞主要涉及CD4+T細胞并且參與了肺血管的重塑，T細胞介導(dǎo)的炎癥早于以肺動脈為特征的血管重塑以及右心室的重構(gòu)[9]。

連接蛋白(Connexin,Cx)廣泛表達在免疫系統(tǒng)中，其中Cx40、Cx43表達在免疫細胞上[10]，由連接蛋白構(gòu)成的縫隙連接通道或半通道與免疫炎癥應(yīng)答密切相關(guān)[11]。在急性或慢性肺部炎癥疾病的免疫應(yīng)答過程中，免疫細胞的增殖、活化和成熟也需要依賴于連接蛋白的作用[12,13]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在自發(fā)性高血壓大鼠外周血中CD4+T、CD8+T淋巴細胞上Cx40和Cx43表達顯著高于對照組，且與促炎因子IL-2和IL-6的表達呈正相關(guān)，應(yīng)用縫隙連接通道特異性阻斷劑Gap27干預(yù)后，以上兩種促炎細胞因子的表達顯著下調(diào)。然而，T淋巴細胞上連接蛋白在PAH誘導(dǎo)的炎癥應(yīng)答中扮演何種角色并不清楚。因此，本項目以SD大鼠為研究對象，制備PAH模型探討T淋巴細胞上連接蛋白是否參與了肺動脈高壓的炎癥應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 隨機選取12周齡SD大鼠12只，雄性，清潔級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[動物合格證號：SCXK(京)2012-0001]，動物房室內(nèi)溫度20～25 ℃，濕度為50%～55%。各組大鼠分籠喂養(yǎng)，給予標準詞料，自由進食水，環(huán)境安靜。

1.1.2主要試劑和儀器 野百合堿(Monocrota-line,MCT,美國Sigma公司)；大鼠白細胞介素(Interleukin,IL)6、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；淋巴細胞分離液(天津灝洋科技有限公司)；FITC anti-rat CD3 抗體、APC anti-rat CD4 抗體、PE anti-rat CD8抗體(美國Biolegend 公司)；Anti-mouse-Connexin 43 抗體(美國Abcam 公司)；Connexin 43 FITC標記二抗(北京聯(lián)科生物公司)；Anti-Goat-Connexin 40抗體(美國Santa Cruz公司)；Connexin 40 FITC標記二抗(北京聯(lián)科生物公司)；固定劑緩沖液Fixation Diluent、固定液Fixation Concentrate、破膜緩沖液Permeabilization buffer(美國eBioscience 公司)；低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；流式細胞儀(深圳邁瑞公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；倒置相差顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組 隨機取12只SD雄鼠分為PAH組(1%的野百合堿溶液腹腔一次性注射60 mg/kg，4周)和正常對照組(腹腔注射生理鹽水)，普通喂養(yǎng)，每組6只，每日觀察。

1.2.2記錄右心室肥大指數(shù) 取血后立即處死大鼠，剖開胸腔取出心肺組織，小心剝離左、右心房和主動脈、肺動脈，分離右心室游離壁(Right ventricular,RV)與室間隔+左心室interventricular septum,IVS+left ventricular,LV),用冰的0.9%氯化鈉溶液洗去血液，用濾紙吸取表面水分稱重，計算右心室肥大指數(shù)RVHI=RV/(IVS+LV)。

1.2.3大鼠肺臟病理學(xué)的觀察并計算肺中小動脈WT%及WA% 各組大鼠麻醉后取左葉肺臟，進行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺臟病理學(xué)改變。為了評價肺血管重建，選擇管壁厚度占血管外徑的百分比(WT%)和肺動脈管壁面積與管總面積的百分比(WA%)為指標。每只大鼠選取肺中、小動脈,使用Image J軟件進行形態(tài)計量分析,由病理科兩位醫(yī)師盲法測量管壁厚度(WT)、血管外徑(ED)，平均血管總面積(TA)和血管腔面積(IA)，計算WT%和WA%，WT%=(2×WT/ED) ×100%，WA%=(TA-IA)/TA×100%。

1.2.4ELISA方法測定肺組織勻漿IL-6、TNF-α 取各組動物冰凍肺組織的右肺下葉100 mg,加入1 ml 預(yù)冷勻漿緩沖液,用組織剪先將組織剪成小塊后用勻漿儀勻漿冰上操作,之后4℃孵育1 h。高速離心5 000 r/min，4℃離心20 min取上清，按酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒說明操作，分別檢測各組中IL-6、TNF-α蛋白水平。

1.2.5流式細胞染色及肺組織T淋巴細胞亞群表達 將對照組和PAH組肺臟剪碎、研磨；取懸液于15 ml離心管中,1 500 r/min離心10 min，棄上清,沉淀用5 ml PBS重懸；取一支15 ml 離心管，加入等體積淋巴細胞分離液，將重懸的組織液體緩慢加入淋巴細胞分離液上層，密度梯度離心法1 500 r/min離心30 min，取淋巴細胞層吸出至1.5 ml EP管內(nèi)，加入2 ml生理鹽水1 800 r/min離心6 min，洗滌2次，棄上清，沉淀即淋巴細胞。設(shè)立陰性對照和空白對照，用300 μl PBS重懸淋巴細胞，分別加入相應(yīng)流式抗體(CD3 FITC;CD4 APC;CD8 PE)。室溫孵育30 min，上機檢測。

1.2.6流式細胞儀檢測T淋巴細胞CD4Cx40和CD4Cx43的表達 收集肺組織淋巴細胞50 μl于離心管中，加入CD3-FITC、CD4-APC和CD8-PE表面抗體，4℃避光孵育30 min，加入500 μl PBS，1 800 r/min 離心6 min，棄上清；加入120 μl固定劑，4℃孵育20 min；加入300 μl 1×破膜劑，1 800 r/min離心6 min，棄上清，加入100 μl 破膜劑，37 ℃孵育20 min；測定管分別加1 μl Cx43/Cx40一抗混勻，室溫孵育30 min，再加入1 μl FITC 標記二抗，室溫避光孵育30 min，加入500 μl PBS 洗滌細胞2次加入300 μl PBS重懸細胞，吹打混勻，上機流式檢測。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀況及RVHI的變化 對照組大鼠進食飲水正常，毛發(fā)光澤，體質(zhì)量隨時間逐漸增加；PAH組大鼠較對照組進食飲水量減少，大鼠逐漸出現(xiàn)體毛暗淡、呼吸急促、行動反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，體質(zhì)量明顯減輕且活動度明顯減低，實驗結(jié)束前均無大鼠死亡。經(jīng)野百合堿干預(yù)4周后,與對照組比較，PAH組右心室重量與RVHI明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,表 1)，造模成功。

2.2肺組織病理學(xué)改變及大鼠肺中小型動脈WT%和WA%的比較 肺組織HE染色于光鏡下顯示，觀察兩組大鼠肺中小型動脈結(jié)構(gòu)差異:對照組大鼠肺中型動脈內(nèi)皮細胞的連續(xù)性好，細胞分布均勻，厚薄一致，血管周圍無炎性細胞浸潤；PAH大鼠的肺中型動脈內(nèi)皮細胞連續(xù)性破壞，呈現(xiàn)出立方形或柱狀突向血管腔，管壁厚度明顯增厚，管腔面積明顯縮小，伴有明顯的血管周圍炎癥(圖1)。對照組的肺小型動脈管壁薄，管腔面積大；PAH大鼠肺小型動脈管壁明顯增厚,管腔狹窄,血管周圍有明顯炎性細胞浸潤(圖2)。PAH組大鼠的肺中小型動脈較對照組出現(xiàn)明顯的血管重構(gòu)和血管周圍炎性細胞浸潤,與Control組比較，PAH組大鼠肺中型動脈以及肺小型動脈WT%和WA%均明顯增高，MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠出現(xiàn)明顯的血管重構(gòu)(P<0.05,表2)。

GroupsControl groupPAH groupRV weight(g)0.15±0.010.32±0.031)IVS+LV weight(g)0.65±0.030.62±0.05RVHI(%)22.33±0.9451.62±2.961)

Note：Compared with control group，1)P<0.05,RVHI=RV/(IVS+LV).

2.3MCT誘導(dǎo)PAH大鼠肺組織勻漿中IL-6、TNF-α水平的影響 與Control組比較，PAH組大鼠肺組織勻漿中IL-6含量升高(P<0.05)；與Control組比較，PAH組大鼠的TNF-α含量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，表3)。

2.4MCT誘導(dǎo)PAH組大鼠肺組織勻漿中T淋巴細胞亞群表達 流式細胞術(shù)檢測對照組大鼠和PAH組肺組織勻漿中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+的頻率，結(jié)果顯示：PAH組肺組織勻漿中CD3+表達比率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PAH組肺組織勻漿中CD3+CD4+表達比率高于對照組；PAH組肺組織勻漿中CD3+CD8+表達比率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PAH組肺組織勻漿中CD4+/CD8+表達比率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

圖1 對照組和PAH組大鼠肺中型動脈HE染色Fig.1 Hematoxylin and eosin staining of middle pulmonary artery between control and PAH ratsNote: A.Control group(×200);B.PAH group(×200);C.Control group(×400);D.PAH group(×400).

圖2 對照組和PAH組大鼠肺小型動脈HE染色Fig.2 Hematoxylin and eosin staining of small pulmonary artery between control and PAH ratsNote: A.Control group(×200);B.PAH group(×200);C.Control group(×400);D.PAH group(×400).

GroupsMedium-sized pulmonary arteryWT%WA%Small-sized pulmonary arteryWT%WA%Control group11.20±3.6731.76±1.0416.86±1.4455.32±1.50PAH group62.40±3.841)87.04±2.101)57.83±2.691)93.23±0.571)

Note：Compared with control group，1)P<0.05.

GroupsIL-6TNF-αControl group82.90±2.1087.72±9.46PAH group102.20±2.301)127.20±2.701)

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖3 流式細胞術(shù)檢測兩組大鼠肺組織T淋巴細胞亞群的表達比例Fig.3 Percentage of T lymphocyte subsets in lung of control and PAH rats were detected by flow cytometryNote: *.P<0.05.

2.5肺組織勻漿中CD4+T淋巴細胞Cx40、Cx43與細胞因子的相關(guān)性分析 肺組織勻漿中CD4+Cx40與細胞因子IL-6、TNF-α呈顯著正相關(guān)，肺組織勻漿中CD4+Cx43細胞因子IL-6、TNF-α同樣呈顯著正相關(guān)性(表4)。

表4 CD4+Cx40和CD4+Cx43與炎癥因子的相關(guān)性分析

Tab.4 Corelation analysis of CD4+Cx40/Cx43 and infla-mmatory cytokines

CytokinesCD4+Cx40+CD4+Cx43+IL-6r=0.881r=0.833P=0.004P=0.010TNF-αr=0.905r=0.952P=0.002P=0.001

圖4 流式細胞術(shù)檢測兩組大鼠肺組織CD4+ Cx40、CD4+Cx43的表達比例Fig.4 Percentage of CD4+Cx40 and CD4+Cx43 in lung of control and PAH rats were detected by flow cytometryNote: **.P<0.01.

2.6MCT誘導(dǎo)PAH組大鼠肺組織CD4+上Cx40、Cx43的表達 流式細胞術(shù)檢測對照組大鼠和PAH組肺組織勻漿中CD4+Cx40、CD4+Cx43的表達比率，結(jié)果顯示：PAH組肺組織勻漿中CD4+Cx40表達比率為(45.02±5.00)%高于對照組(28.63±8.29)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；PAH組肺組織勻漿中CD4+Cx43表達比率為(47.88±4.53)%高于對照組(31.50±9.39)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

3 討論

肺動脈高壓是多種生理途徑和細胞類型引起的多因素的病理生理改變，包括肺血管收縮、增殖，血管阻塞性重構(gòu)，炎性浸潤及原位血栓形成等機制。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)免疫炎癥應(yīng)答機制在肺動脈高壓、原發(fā)性高血壓及動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病過程中具有重要作用。Tamosiuniene等[14]提出在PAH大鼠模型中，炎癥的發(fā)生先于血管重塑，這顯示出炎癥是血管疾病的起因而不是結(jié)果。炎癥細胞釋放出大量的細胞因子、趨化因子和黏附分子，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細胞損傷和平滑肌細胞的增殖[15]。MCT是一種雙化咯類生物堿，它可使肺血管內(nèi)皮產(chǎn)生不可逆性的損傷，進而血管活性物質(zhì)、炎癥因子釋放增加，從而引發(fā)血管重構(gòu)、血管收縮、平滑肌細胞異常增生[16]。本研究通過注射MCT建立PAH模型，檢測肺動脈高壓引起的肺臟炎性改變，發(fā)現(xiàn)PAH大鼠肺動脈血管壁增厚，管腔狹窄，肺泡膜增厚，肺中小動脈周圍有明顯的炎癥細胞浸潤，肺組織勻漿中IL-6、TNF-α的水平顯著升高，這表明肺動脈高壓與肺部炎性反應(yīng)密切相關(guān)。

CD4+T細胞刺激抗原提呈細胞和CD8+T淋巴細胞成熟活化，促進細胞發(fā)揮免疫應(yīng)答反應(yīng)，在機體免疫反應(yīng)和自身免疫等方面發(fā)揮著重要的作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓伴隨著肺部CD4+T細胞增高和CD8+T淋巴細胞降低，與Cuttica等發(fā)現(xiàn)PAH大鼠肺部CD4+T細胞數(shù)量增高結(jié)果相一致[9,18]。Edward等[19]研究顯示T細胞缺陷的老鼠更容易發(fā)展成為PAH，而注射內(nèi)皮祖細胞后疾病有所改善，同時也在PAH患者中發(fā)現(xiàn)CD4/CD8升高的現(xiàn)象。本研究主要對肺臟中T淋巴細胞亞群在肺動脈高壓疾病狀態(tài)時的表達變化進行探討。結(jié)果顯示，與相同周齡的對照組大鼠比較，PAH大鼠肺臟中CD3+T淋巴細胞比例增高，CD3+CD4+表達比例增高；CD4+/CD8+在PAH大鼠明顯升高，較對照組發(fā)生紊亂，此結(jié)果提示肺動脈高壓大鼠體內(nèi)免疫平衡被打破，使淋巴細胞亞群表達發(fā)生異常改變。

已有研究表明，Cx40、Cx43在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和炎癥應(yīng)答具有重要作用[11]，但對于淋巴細胞上Cx40、Cx43的表達在炎癥參與的肺動脈高壓過程中的變化尚不清楚。有研究證實Cx40、Cx43在肺組織中的表達有助于通過細胞內(nèi)和細胞外的信號傳導(dǎo)來控制體內(nèi)的平衡[20]。炎癥是PAH的特征之一[21]，肺部炎癥過程中活化的T淋巴細胞中Cx43形成的縫隙連接通道參與IFN-γ的合成與分泌，進而促進Cx43的表達上調(diào)[2]。本研究顯示肺動脈高壓大鼠CD4+T淋巴細胞中Cx43、Cx40表達顯著高于對照組，進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大鼠肺組織勻漿中細胞因子IL-6、TNF-α與CD4+T淋巴細胞上Cx40和Cx43高表達呈顯著正相關(guān)，上述結(jié)果提示肺動脈高壓的肺部炎癥與縫隙連接蛋白的表達及功能密切相關(guān)。然而，免疫系統(tǒng)中的連接蛋白在PAH的炎癥發(fā)生過程中如何發(fā)揮信息傳遞作用并不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，本研究主要發(fā)現(xiàn)肺動脈高壓時伴隨炎癥反應(yīng)，CD4/CD8免疫平衡發(fā)生紊亂，Cx40、Cx43 在CD4+T淋巴細胞的表達升高，但具體機制尚不清楚，本研究有助于我們進一步探討連接蛋白在肺動脈高壓炎癥反應(yīng)中調(diào)控的機制，從而為肺動脈高壓的免疫靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。