阿托伐他汀在致死型約氏瘧原蟲感染的肝臟病理損傷中的作用研究①

付俁蕭 黃 旭 呂 童 李丹妮 曹雅明 馮 輝

(中國醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，沈陽110122)

瘧疾是主要的全球衛生問題之一，宿主免疫應答在瘧疾感染的發病、嚴重程度和預后中起重要作用。這促進了以改善瘧疾臨床癥狀為目的的免疫調節性輔助治療方案的推進[1]。阿托伐他汀(Atorvastatin，AVA)是肝臟3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶抑制劑，是目前有效的他汀類降脂藥。阿托伐他汀不僅具有重要的調脂作用，還可改善內皮祖細胞功能、發揮抗氧化和抗炎作用[2-4]。

體外實驗證實，在多種他汀類藥物中AVA對惡性瘧原蟲增殖的抑制作用最明顯，它對22株不同藥敏譜的惡性瘧原蟲均具有體外抑制作用[5，6]。體外交叉耐藥實驗顯示，AVA治療與氯喹等喹啉類抗瘧藥相關轉運蛋白基因突變無關[6]。AVA與甲氟喹或雙氫青蒿素聯合用藥，可明顯緩解伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei，P.b)ANKA株感染的腦瘧癥狀和原蟲血癥，并推遲小鼠死亡時間[7,8]。由此提示，AVA是他汀類藥物中與抗瘧藥物聯合使用后效果良好的候選藥物。

肝臟是瘧原蟲紅前期發育所必需的場所。研究顯示，瘧原蟲紅內期累及肝臟導致肝功能異常的現象也較常見。P.bNK65株感染可引起小鼠肝臟過度氧化應激；夏氏瘧原蟲(PlasmodiumchabaudiAS，P.cAS)感染導致小鼠肝臟產生大量細胞因子引起肝臟炎癥[9]。一項134例瘧疾患者(單純惡性瘧、間日瘧和混合感染)前瞻性研究發現，高膽紅素血癥發生率為41.04%，血清谷草轉氨酶升高3倍以上占17.16%。肝功異常比瘧疾肝病更為常見[10]。因此，瘧疾感染肝臟的病理學研究對指導臨床診斷和治療具有重要意義。

AVA經肝首過代謝，口服吸收良好。為此，本研究采用口服AVA單藥或與青蒿琥酯(Artesunate，AS)聯合用藥，觀察AVA在致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)感染中的治療效果，評估AVA單藥在瘧疾感染肝臟的病理損傷中的作用，為闡明AVA在瘧疾輔助治療中的作用及免疫調節機制提供基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1材料 健康SPF級別雌性BALB/c小鼠，8～10周齡(50只)，購自北京維通利華公司。P.y17XL由中國醫科大學免疫學教研室實驗室液氮保種。阿托伐他汀鈣購自上海Macklin，青蒿琥酯購自桂林南藥股份有限公司，Percoll購自美國GE healthcare，無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水、中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司，蘇木素染液、伊紅染液、EDTA抗原修復液、HRP山羊抗兔二抗以及DAB顯色劑購自中國Servicebio。流式抗體BV421-anti-CD3、FITC-anti-CD8a、PE-Cy5-anti-CD8a、PE-anti-CXCR6、PE-Cy7-anti-CD4、APC-anti-CD49b和FITC-anti-CD314購自美國Biolegend、BD公司及天津三箭公司，組化抗體兔抗小鼠CD4和CD8抗體購自北京Bioss。組織切片掃描儀(Pannoramic MIDI，3D Histech，匈牙利)；流式細胞儀(FACSCelesta，BD，美國)。

1.2方法

1.2.1動物模型的制備 液氮保種P.y17XL通過感染紅細胞復蘇后，腹腔感染BALB/c小鼠(0.1 ml/只，i.p.)。待原蟲血癥達10%左右，小鼠麻醉狀態下EDTA抗凝心臟采血，取1×103P.y17XL 感染紅細胞尾靜脈感染BALB/c小鼠(0.1 ml/只，i.v.)。尾靜脈血涂片Giemsa染色，計數原蟲血癥和觀察生存率。

1.2.2阿托伐他汀鈣劑的制備 美國心臟協會降膽固醇治療指南推薦的阿托伐他汀每日成人劑量為中效(10～20 mg/d)和強效劑量(40～80 mg/d)[11]。根據美國食品藥品監督管理局發布的小鼠對人體劑量轉換指南[12]，本研究AVA灌胃劑量為3 mg/(kg·d)，折合成人體(60 kg)用量14.4 mg/d。AVA粉末加入雙蒸水中(0.1% DMSO)超聲溶解(75% 振幅，開5 s，關 10 s，共5 min)。

1.2.3實驗分組 AVA用藥效果觀察分4組，對照組(12只)：給予等量溶劑；AVA單藥組(12只)：從瘧原蟲感染當天開始，AVA連續灌胃8 d(200 μl/只)；AS單藥組(12只)：感染第7天起，AS連續灌胃3 d；AVA+青蒿琥酯(AS)組(12只)：AVA給藥8 d，感染第7天起連續3 d給予AS[25 mg/(kg·d)，NaHCO3稀釋]灌胃。

1.2.4HE染色 4%多聚甲醛固定肝臟，制備石蠟切片。依次將切片放入二甲苯Ⅰ處理20 min，二甲苯Ⅱ處理20 min，無水乙醇Ⅰ處理5 min，無水乙醇Ⅱ處理5 min，75%乙醇處理5 min，自來水洗。經蘇木素染色、伊紅染色，脫水封片。細胞核呈藍色，細胞質呈紅色。

1.2.5免疫組化 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，分別加入CD4或CD8抗體，4℃孵育過夜。加入HRP標記的二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色，復染細胞核，脫水封片。

1.2.6免疫組化結果分析 組化染色的組織切片經組織切片掃描儀全片掃描。利用Quant center軟件分析組織切片的染色強度。判斷方法如下：深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍色細胞核為陰性。進而對組織進行識別分析出強陽性、中度陽性、弱陽性、陰性的面積(單位：像素)和陽性百分比，最后進行組織化學評分(Histochemi-stry score，H-Score)[13]。

1.2.7小鼠肝臟單個核細胞制備 感染第7天時，麻醉狀態下頸椎脫位處死小鼠。打開腹腔，下腔靜脈插管，灌注5～10 ml PBS，見肝臟膨脹后切斷門靜脈，排出殘血和灌流液。肝組織置于200目篩網研磨，取50 ml研磨液4℃靜置10 min，取35 ml上層細胞懸液，450～500 g離心10 min，棄上清。加入適量紅細胞裂解液，4℃作用5～7 min，450～500 g離心10 min，棄上清。用40% Percoll重懸細胞，重層于等體積70% Percoll上。22～24℃、1 500 g離心45 min，取灰白層細胞，PBS洗一次后定容于1 ml中，計數細胞濃度。

1.2.8流式細胞術染色 調整肝淋巴細胞濃度為1×106個/100 μl，設陰性對照管和單標管。每份樣品同時加入BV421-anti-CD3、FITC-anti-CD8a、PE-anti-CXCR6、PE-Cy7-anti-CD4或BV421-anti-CD3、FITC-anti-CD314、PE-anti-CXCR6、APC-anti-CD49b或BV4 21-anti-CD3、FITC-anti-CD314、PE-Cy5-anti-CD8a抗體，4℃孵育30 min。PBS洗細胞1次，棄上清，300 μl 定容，利用流式細胞儀獲取細胞，結果以點陣圖顯示。利用FlowJo 7.6.1分析流式結果。

2 結果

2.1AVA治療控制原蟲快速增殖并延緩P.y17XL疾病進展 對照組在P.y17XL感染第4天，鏡下可見感染瘧原蟲紅細胞，表明P.y17XL感染模型建立成功。感染后第6天感染率達20%左右，各組感染率無顯著差異。感染后第7天，對照組感染率迅速上升至61.8%，而AVA組感染率為41.2%，明顯低于對照組(P<0.05)。隨后，對照組小鼠出現死亡。AVA組的感染率峰值出現時間推遲，當感染率達到峰值時小鼠出現死亡(P<0.05)。AS組和AVA+AS組在感染后第7天接受青蒿琥酯治療，感染率從第8天開始降低，原蟲血癥得到有效控制(見圖1)。

2.2AVA治療減輕P.y17XL瘧色素在肝臟沉積和對肝細胞的損傷 感染后第7天肝臟HE染色顯示，對照組肝細胞胞質內和肝竇內多見棕褐色沉積物(瘧色素)，肝板結構紊亂，肝細胞出現嗜酸性壞死。AVA組肝組織瘧色素沉積不明顯，肝細胞排列紊亂，胞質內可見較多小的圓形空洞，出現微泡性脂肪變性但未見肝細胞壞死，見圖2。

圖1 P.y 17XL感染BALB/c小鼠感染率和生存率觀察Fig.1 Parasitemia and survival of BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: *.P<0.05,AVA vs control group.

免疫組化顯示，AVA組肝臟CD4強陽性細胞比例明顯增加，對照組偶見CD4+T細胞。與對照組H-Score評分結果相比，AVA組肝臟CD4+T細胞(310.73±24.80 vs 258.12±12.31，P<0.01)和CD8+T細胞(207.82±36.23 vs 165.15±22.04，P<0.05)細胞比例明顯增加，見圖3。

2.3AVA治療增加肝臟淋巴細胞數量 感染后第7天流式結果顯示，與對照組相比，AVA組總T細胞數量明顯增加(P<0.05)，其中以CD4+T細胞增加為主(P<0.05)，CD8+T細胞數量亦出現明顯升高(P<0.05)，見圖4。

2.4AVA治療趨化CXCR6+T細胞在肝臟募集 感染后第7天與對照組相比，AVA組表達CXCR6的CD4+T、CD8+T細胞數量明顯增加(P<0.05，P<0.01)。同時，CXCR6+NKT細胞數量明顯上升(P<0.05)，見圖5。

圖2 P.y 17XL感染BALB/c小鼠肝組織HE染色Fig.2 HE staining of liver tissue in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: Red circle indicates the location of malarial pigmentation,yellow arrow indicates necrotic hepatocytes.

圖3 P.y 17XL感染BALB/c小鼠肝組織組化染色Fig.3 Histochemical staining of liver tissue in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: IHC for CD4+T cell(A and C);IHC for CD8+T cells(B and D).

圖4 P.y 17XL感染BALB/c小鼠肝臟T淋巴細胞流式染色Fig.4 FACs analysis of liver T lymphocytes in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: Compared with control,*.P<0.05.

圖5 P.y 17XL感染BALB/c小鼠肝臟淋巴細胞CXCR6+T細胞流式染色Fig.5 Expression of CXCR6+T lymphocytes in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: Compared with control,*.P<0.05，**.P<0.01.

2.5AVA治療上調NKG2D在NKT細胞中的表達 感染后第7天流式結果顯示，與對照相比，AVA組NKG2D+CD8+T細胞和NKG2D+NKT細胞數量明顯增加(P<0.05)，見圖6。

圖6 P.y 17XL感染BALB/c小鼠淋巴細胞NKG2D表達Fig.6 Expression of NKG2D in T lymphocytes in BALB/c mice infected with P.y 17XLNote: Compared with control，*.P<0.05.

3 討論

瘧疾的免疫發病機制是復雜的過程，針對單一途徑治療可能不足以降低死亡率或改善臨床表現。研究顯示，普伐他汀、氟伐他汀、辛伐他汀和AVA分別以40 mg/kg劑量腹腔注射給藥，單藥對小鼠腦瘧的發生和存活率無明顯影響[14-16]。本研究采用等同成人口服AVA中等用藥劑量3 mg/(kg·d)灌胃小鼠，發現在感染早期AVA可有效控制P.y17XL瘧原蟲快速增殖，推遲原蟲血癥峰值出現。AVA是脂溶性藥物，經肝臟代謝，口服用藥效果更佳。AVA腹腔注射劑量達40 mg/kg時，藥物會產生免疫抑制效應[17]。由此，他汀類藥物的給藥方式和給藥劑量明顯影響抗瘧療效，結合本研究結果推薦采用低劑量口服給藥。

肝臟是紅細胞快速清除和鐵循環的主要場所，也被認為是一種獨特的免疫器官[18，19]。瘧色素可誘導多種趨化因子表達，招募炎癥性細胞趨化至肝臟[20]。一項無并發癥惡性瘧患者肝損傷隊列研究顯示，低原蟲負荷引起的肝損傷與抗瘧藥物肝毒性無關，誘導炎癥可能是肝損傷的主要驅動因素[21]。本研究發現，AVA單藥治療可降低瘧色素在肝臟沉積，肝臟病理損傷緩解可能與瘧色素沉積減少有關。常見抗瘧藥物氯喹或青蒿素尚未表現出肝臟保護效應，AVA在改善瘧疾肝臟病理方面的作用，為其成為抗瘧輔助用藥提供了更好的應用前景。

研究顯示，他汀類藥物在輔助瘧疾治療中的作用機制表現在：①減少腦部炎癥和微膠質細胞活化并改善大腦微血管，預防腦瘧后認知障礙[22]；②降低腦組織CXCL10表達以減少實驗性腦瘧發生[7,23]；③保護內皮細胞免受惡性瘧原蟲引起的側支損傷、細胞凋亡和內皮屏障的通透性[24]。CXCR6是新型趨化因子CXCL16的唯一受體，膜結合型CXCL16廣泛分布在肝血管內皮和肝血竇內皮細胞表面[25]，CXCR6可介導NKT和CD4+T細胞清除衰老肝細胞，防止肝癌發生[26]，對減毒子孢子免疫誘導的肝臟記憶CD8+T細胞發育和維持至關重要[27]。本研究發現，AVA單藥治療可增加肝臟CXCR6+T細胞數量，升高CD8+T細胞和NKT細胞活化性受體NKG2D表達。由此，AVA治療可能通過改善肝臟微環境促進趨化因子表達，進而募集CXCR6+T細胞向肝臟趨化，參與肝臟瘧原蟲的清除。

瘧疾輔助治療的開展將有助于更全面地理解瘧疾感染引起的生理和病理學改變。抗瘧藥和輔助用藥的聯合使用通過提高療效和減少并發癥使瘧疾感染的控制更為有效。深入探討藥物治療的生物靶標可為抗瘧治療提供新的治療靶點。